崔鳳娟，曾 瑾，王海珍，張根葆，王海華

(皖南醫(yī)學院 1.生理學教研室;2.蛇毒蛇傷研究所，安徽 蕪湖 241002)

蜂膠(propolis)是蜜蜂從膠原植物幼芽、樹皮上采集的樹脂類物質(zhì)，混以蜜蜂上顎腺、蠟腺分泌物。近年來，研究發(fā)現(xiàn)蜂膠主要有廣譜抗菌、抗炎癥、抗腫瘤等作用，對心血管系統(tǒng)疾病、糖尿病亦有治療作用［1］。體內(nèi)外實驗均表明，蜂膠具有顯著的抗氧化活性，能清除自由基，提升抗氧化酶活性，抑制脂質(zhì)過氧化［2－3］。但是，蜂膠對 H2O2所致的乳鼠心肌細胞損傷的相關(guān)作用，尚未見報道。本文擬以H2O2復(fù)制乳鼠心肌細胞損傷模型［4］，用不同劑量蜂膠孵育，探討蜂膠對心肌細胞氧化損傷的作用及可能機制，為蜂膠在臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 出生2～3 d的SD乳鼠，雌雄不拘，動物合格證號:SCXK(蘇)2009-0001。

1.2 主要試劑與藥品 蜂膠(購自中國藥品生物制品檢定所)，用二甲基亞砜(DMSO)配制成105mg/L 的母液，用時稀釋，DMSO 終濃度≤0.1%［5］;DMEM高糖培養(yǎng)基(購自Hyclone公司);胎牛血清(購自杭州四季青公司);胰蛋白酶(購自碧云天生物技術(shù)研究所);Ⅱ型膠原酶、5-溴脫氧尿嘧啶(5-Brdu)及甲基四唑藍(MTT)(購自美國Sigma公司);H2O2系國產(chǎn)分析純;超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及乳酸脫氫酶(LDH)測定試劑盒(購自南京建成生物工程研究所);α-橫紋肌肌動蛋白單克隆抗體(α-sarcomeri cactin，α-SA)及鏈霉素親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(Strep-tAvidin-iotin peroxydase Complex，SABC)免疫組化試劑盒(購自武漢博士德生物工程有限公司)，實驗中所用其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

1.3 主要實驗儀器 倒置熒光顯微鏡(日本Olympus)、YJ-1450 SA型超凈工作臺(蘇州市凈化設(shè)備廠)、Model-680型酶標儀(美國 BIO-RAD)、UV-3200PCS紫外可見分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)、恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo)、90-1型恒溫磁力攪拌器(上海滬西分析儀器廠)等。

1.4 方法

1.4.1 原代心肌細胞培養(yǎng) 取2～3 d的SD乳鼠，無菌操作開胸剪去心臟，用0.125%胰蛋白酶和0.08%膠原酶Ⅱ的混合酶分次消化法分離細胞，1 000 r/min離心 8 min沉淀細胞，5-Brdu(0.1 mmol/L)及差速貼壁法純化心肌細胞。將細胞密度調(diào)整至3 ×105個/ml，每孔 100 μl加入 96 孔板，直至細胞長成致密單層后用于實驗［6］。實驗前將原含血清培養(yǎng)液換為無血清培養(yǎng)液。

1.4.2 心肌細胞的形態(tài)學觀察 剛分離的心肌細胞呈圓形，培養(yǎng)2～4 h細胞開始貼壁生長，變?yōu)樗笮?，逐漸展開，伸出偽足，變?yōu)槿切巍⑿切?、多邊形?培養(yǎng)24 h后細胞基本全部貼壁，多呈現(xiàn)梭形(見圖1A);培養(yǎng)48h后細胞呈梭形并伸出偽足互相交織，逐漸形成細胞簇(見圖1B);培養(yǎng)72 h后細胞伸出的偽足相互接觸交織成網(wǎng)，細胞簇呈放射狀排列的同心圓狀，搏動呈同步性，收縮有力，形成功能性合胞體(見圖1C)。

圖1 原代心肌細胞培養(yǎng)(×200)Fig 1 Primarily cultured cardiomyocytes(×200)

1.4.3 心肌細胞免疫組化鑒定 無菌條件下取出原代培養(yǎng)第3 d的細胞爬片，4%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗3次，用橫紋肌肌動蛋白(α-actin)單克隆抗體作為一抗，SP法 DAB顯色免疫細胞化學染色，取磷酸鹽緩沖液(PBS)作為一抗的陰性對照。由于α-SA僅在心臟中的心肌細胞呈陽性表達，位于胞漿為棕黃色，而在非心肌細胞中表達陰性，故可將其作為心肌細胞純度鑒定的指標(見圖2A、B)。

圖2 心肌細胞鑒定×200Fig 2 Myocardial cell identifications×200

1.5 實驗分組

1.5.1 H2O2對乳鼠心肌細胞的氧化損傷 選擇生長良好、搏動規(guī)律的心肌細胞，隨機分為6組:正常對照組，不加H2O2處理;H2O2損傷組，加入不同濃度的 H2O2(50、100、200、400、800 μmol/L 后再孵育4 h。然后測定細胞存活率、培養(yǎng)液LDH活性及MDA含量，并觀察細胞形態(tài)學變化。

1.5.2 蜂膠預(yù)處理對H2O2引起的氧化損傷 將心肌細胞隨機分為6組:正常對照組，不加蜂膠及H2O2;DMSO溶劑對照組，加入含DMSO(＜0.1%)的培養(yǎng)基培養(yǎng);模型組，H2O2(400 μmol/L)孵育4 h;蜂膠組，加入不同劑量蜂膠(50、100、200 mg/L)預(yù)先孵育心肌細胞12 h，然后加入H2O2(400 μmol/L)繼續(xù)孵育4 h。每個濃度設(shè)6個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.6 檢測指標

1.6.1 心肌細胞存活率 采用甲基四唑藍(MTT)比色實驗，它是一種檢測細胞存活和生長的方法。將相應(yīng)處理后的心肌細胞接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每組設(shè)6個復(fù)孔，每孔加入 MTT(5 mg/ml)20 μl，繼續(xù)37℃孵育4 h，小心吸出培養(yǎng)上清，再向每孔加入DMSO 150 μl溶解結(jié)晶，微型振蕩器上振蕩約10 min，用酶標儀測定波長490 nm處的OD值。取每組的OD均值。按公式計算心肌細胞存活率:

1.6.2 心肌細胞形態(tài)學變化 接種于24孔培養(yǎng)板中的各組心肌細胞經(jīng)過相應(yīng)處理后，于倒置顯微鏡下觀察心肌細胞的形態(tài)學改變并拍攝照片。

1.6.3 LDH、SOD、MDA的檢測 取細胞培養(yǎng)上清50 μl，LDH測定采用比色法，SOD測定采用黃嘌呤氧化酶法，MDA測定采用硫代巴比妥酸比色法，具體操作按照試劑盒說明書進行。

1.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學處理與數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)以s表示，多組之間采用單因素方差分析(F檢驗)進行比較，多組間兩兩均數(shù)比較采用SNK法(q檢驗)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義，P＜0.01為差異具有顯著性統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 乳鼠心肌細胞的形態(tài)學變化 對照組心肌細胞伸出偽足相互接觸交織成網(wǎng)，逐漸形成細胞簇，呈放射狀排列的同心圓狀，搏動呈同步性，收縮明顯有力;H2O2損傷組心肌細胞部分皺縮，細胞核暗淡，偽足消失，搏動減慢，心肌細胞胞體變小，細胞間橋結(jié)構(gòu)減少，胞間隙明顯增加。加入不同濃度的蜂膠組細胞的形態(tài)和搏動狀態(tài)均比模型組有明顯的好轉(zhuǎn)，心肌細胞的偽足回縮減輕，細胞間連接增多，搏動節(jié)奏有所恢復(fù)(見圖3)。

圖3 蜂膠作用于H2O2損傷的乳鼠心肌細胞形態(tài)學變化(×200)Fig 3 Morphological changes of myocardial cells of neonatal rats propolis effects on H2O2damage(×200)

2.2 H2O2誘導(dǎo)心肌細胞氧化損傷 不同濃度H2O2作用于培養(yǎng)的心肌細胞，可見心肌細胞隨著H2O2濃度的增加存活率顯著降低(P＜0.01);培養(yǎng)液中LDH活性明顯升高，MDA含量也顯著地增加，SOD活性顯著降低(P＜0.01)，且呈現(xiàn)H2O2濃度依賴性(見圖4，表1)。

圖4 不同濃度H2O2對乳鼠心肌細胞存活率的影響(±s，n=6)Fig 4 Damage effects of different concentrations of H2O2on the rat myocardial cells(±s，n=6)

表1 H2O2對心肌細胞氧化損傷的影響(±s，n=6)Tab 1 Effect of H2O2on oxidative damage to myocardial cells(±s，n=6)

表1 H2O2對心肌細胞氧化損傷的影響(±s，n=6)Tab 1 Effect of H2O2on oxidative damage to myocardial cells(±s，n=6)

注:與對照組比較，aP ＜0.05，bP ＜0.01

組別 劑量(μmol/L)LDH(U/L)SOD(U/L)MDA(nmol/L)－ 180.13 ±141.55 13.30 ±2.6 11.75 ±0.40 H2O2 組 50 296.86 ±183.27a11.18 ±1.5b12.50 ±0.59b 100 404.04 ±175.33b 9.71 ±1.2b13.18 ±0.51b 200 517.96 ±176.52b 8.10 ±1.04b14.01 ±0.87b 400 651.52 ±185.62b 6.56 ±1.26b14.78 ± 1.05b 800 907.97 ±143.68b 2.63 ±0.72b15.76 ±1.02b F 值 43.32 111.55 65.07 P值對照組0.00 0.00 0.00

2.3 蜂膠對H2O2誘導(dǎo)乳鼠心肌細胞氧化損傷的作用 心肌細胞經(jīng)過不同濃度的蜂膠(50、100、200 mg/L)預(yù)先孵育 12 h，再加入 H2O2(400 μmol/L)孵育4 h，與H2O2模型組比較，蜂膠(100、200 mg/L)可使心肌細胞存活率明顯增加(P＜0.05，P＜0.01)，可明顯降低培養(yǎng)液中LDH活性及MDA含量(P ＜0.01，P ＜0.05)，SOD 活性增加(P ＜0.01)。見圖5，表2。

3 討論

氧化應(yīng)激損傷在心肌缺血、心肌再灌注損傷及心力衰竭等病變中都起著重要的作用［7］。心肌細胞缺氧時，ATP生成減少，分解增多，導(dǎo)致 ADP、AMP增加，后者降解為次黃嘌呤，而次黃嘌呤正是產(chǎn)生氧自由基(oxygen derived free radical，ODFR)的底物［8］。在氧供不足時，黃嘌呤脫氫酶可在鈣依賴蛋白酶的作用下迅速轉(zhuǎn)化為黃嘌呤氧化酶，為氧自由基的產(chǎn)生做好準備。氧自由基具有強烈引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，可引發(fā)鏈式脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，它們幾乎可以同任何細胞成份發(fā)生反應(yīng)，從而達到損傷細胞的目的［9］。正常情況下有少量ODFR生成并無大礙，細胞內(nèi)存在SOD，過氧化氫酶(catalase，CAT)以及谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSHps)，這些酶能及時將體內(nèi)過剩的ODFR還原成水而被清除，但是當ODFR的產(chǎn)生量超過了其清除能力時就會引發(fā)自由基損傷。

圖5 不同劑量蜂膠對H2O2損傷心肌細胞存活率的影響(±s，n=6)Fig 5 Different dosage of propolis on the viability of myocardial cells after H2O2induced injury(±s，n=6)

表2 蜂膠對H2O2誘導(dǎo)心肌細胞氧化損傷的影響(±s，n=6)Tab 2 Protective effects of propolis on the myocardial cells induced by H2O2(±s，n=6)

表2 蜂膠對H2O2誘導(dǎo)心肌細胞氧化損傷的影響(±s，n=6)Tab 2 Protective effects of propolis on the myocardial cells induced by H2O2(±s，n=6)

注:與對照組比較，aP ＜0.05，bP ＜0.01;與 H2O2組比較，cP ＜0.01

劑量LDHSODMDA組別 (mg/L)(U/L)(U/L)(nmol/L)對照組 － 180.13 ±141.55c13.30 ±2.6c 11.75 ±0.40c DMSO 組 － 280.02 ±100.76bc16.21 ±0.79bc12.32 ±1.03ac 0.00 0.00 0.00 H2O2組 － 651.52 ±185.62b 6.56 ±1.26b14.78 ±1.05b蜂膠組 50 633.56 ±40.67b 11.35 ±0.41bc14.84 ±0.53b 100 535.35 ±68.16bc 12.23 ±0.38c13.97 ±0.54bc 200 410.77 ±81.62bc 13.63 ±2.70c13.12 ±0.84bc F 值 52.40 67.35 49.78 P值

本實驗采用外源性給予H2O2誘導(dǎo)乳鼠心肌細胞的氧化應(yīng)激性損傷。H2O2是一種活性氧，其氧化能力很強。外源性H2O2作用于心肌細胞后產(chǎn)生大量氧自由基，后者介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)是導(dǎo)致心肌細胞(尤其生物膜)損傷的重要原因。LDH是胞內(nèi)酶，少量漏出即提示細胞膜通透性增高，漏出量的多少可反映細胞膜的受損程度;SOD是一種存在于細胞液中的抗氧化酶，可清除超氧陰離子，保護細胞免受超氧陰離子損傷，其值高低間接反映了機體清除氧自由基的能力;MDA是氧自由基攻擊生物膜不飽和脂肪酸的終產(chǎn)物，其數(shù)值的高低可間接反映細胞受自由基損傷程度［10］。實驗結(jié)果顯示，H2O2能使培養(yǎng)液中LDH、MDA明顯升高，SOD活性顯著降低，同時心肌細胞形態(tài)損傷明顯，細胞偽足回縮，體積變小，自律搏動減弱;且心肌細胞存活率明顯降低，證實H2O2的心臟毒性作用與脂質(zhì)過氧化損傷有關(guān)。

蜂膠具有廣泛的藥理活性，對心肌損害、缺血再灌注損傷等有保護作用［11－12］，可能與其較強的抗氧化作用有關(guān)［13］。本實驗結(jié)果顯示3種劑量蜂膠預(yù)處理，均能減輕H2O2誘導(dǎo)的LDH釋放量增加和MDA含量增加;呈劑量依賴性防止H2O2誘導(dǎo)的SOD活性降低，細胞存活率升高，細胞形態(tài)學指標亦有顯著改善?？梢姺淠z能有效地減輕H2O2對心肌細胞的損傷作用，維持機體內(nèi)抗氧化酶(SOD)的活性，降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的生成，從而減輕脂質(zhì)過氧化對心肌的損傷，直接抑制活性氧的形成或直接清除已形成的活性氧，進而起到天然抗氧化劑的作用，至于其確切機制有待進一步探討。

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