周玉燕，沈子龍

(1.皖南醫(yī)學院 藥學院，安徽 蕪湖 241002;2.中國藥科大學 生命科學與技術(shù)學院，江蘇 南京 210009)

多糖鐵復(fù)合物(polysaccharide iron complex，PIC)是臨床上用于治療單純性缺鐵性貧血的第三代生物補鐵劑，由于多糖鐵復(fù)合物與鐵離子絡(luò)合的配體是生物大分子多糖，不僅克服了二代補鐵劑胃腸刺激的副作用，釋放的不同配體多糖還具有各種生物功能，如補血、抗腫瘤、抗輻射、抗氧化等［1］，成為目前研究的熱門。研究人員以多種大分子多糖為配體合成多糖鐵復(fù)合物如:滸苔多糖鐵、厚樸葉多糖鐵、百合多糖鐵、當歸多糖鐵、玉米多糖鐵、大豆多糖鐵等［2－8］，在這些多糖鐵中，玉米多糖鐵(CPIC)以其較高的含鐵量和生物利用度，成為具有廣泛應(yīng)用前景的補鐵劑。本課題組先前研究了玉米多糖鐵在SD大鼠體內(nèi)的藥動學過程，發(fā)現(xiàn)服用后能夠顯著提高血液中鐵離子濃度，具有很好的補血效果。為了進一步研究玉米多糖鐵的藥效學，本研究采用原子吸收分光光度法對玉米多糖鐵在畢格犬體內(nèi)的藥代動力學特征進行研究，以期為新藥申報提供進一步的實驗資料和參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 實驗室自制玉米多糖鐵溶液，規(guī)格8 mg/ml;鐵標準溶液，江蘇省疾控中心提供，編號GBW(E)080378，質(zhì)量濃度 1.08 mg/ml;三氟乙酸(分析純)，鹽酸(分析純)，0.9%氯化鈉注射用水等均由南京化學試劑有限公司提供;AA-670型原子吸收分光光度計，shimadzu公司提供;TGL-16型高速離心機，上海安亭科學儀器廠;畢格犬12只(普通級)，上海市新岡實驗動物場，許可證號:SCXK(滬)2002-14。

1.2 玉米多糖鐵的制備 參考文獻［8］，制備玉米多糖鐵溶液。得到玉米多糖鐵溶液的含量為8 mg/ml，經(jīng)亞鐵氰化鉀檢測，溶液中無游離鐵。鄰菲羅啉比色法［9］測定其鐵含量46%。

1.3 直接火焰原子分光光度法［10］測定畢格犬血漿中鐵含量的方法學考察

1.3.1 犬血樣的處理及標準曲線制備 分別準確量取標準鐵溶液(含鐵20 μg/ml)適量，用犬血漿稀釋，然后用1 mol/L HCl處理，經(jīng)85～95℃水浴2～3 min后，用20%的三氟乙酸沉淀，離心后得到鐵含量為 5.0、3.0、1.5、1.0、0.8、0.6、0.4、0.2 μg/ml的標準工作液系列備用。

1.3.2 樣品在血漿中回收率、精密度和穩(wěn)定性測定 ①精密度及準確度:取標準鐵溶液(含鐵20 μg/ml)，用犬血清稀釋至 5.0、1.0、0.2 μg/ml三個濃度的工作液各5份，然后用1 mol/L HCl處理，經(jīng)85～95℃水浴2～3 min后，用20%的三氟乙酸沉淀，12 000 r/min 10 min后取上清，原子吸收分光光度法測A值，計算日內(nèi)精密度及回收率。每日重新配制5.0、1.0、0.2 μg/ml三個濃度的工作液，同上法處理測定，連續(xù)測定5 d，計算日間精密度。②穩(wěn)定性考察:制備 5.0、1.0、0.2 μg/ml三個濃度的工作液各5份，處理后得到質(zhì)控溶液分別考察其在室溫放置0 ～24 h，取 0、10、24 h，測 3 次;－20 ℃ 儲存，隔日各濃度各取出1管測定。于－20℃保存24 h，取出置室溫自然解凍。將其中1組處理后測定吸光度;剩余其他樣品放回冷凍狀態(tài)保持24 h，如此解凍-冷凍重復(fù)循環(huán)兩次以上。測定吸光度。穩(wěn)定性結(jié)果以殘余百分數(shù)表示，計算公式為:

1.4 多糖鐵在畢格犬中的藥代動力學參數(shù)測定畢格犬12只，隨機分為3組，雌雄各半，禁食，自由飲水。分別灌胃給予高劑量(11 mg/kg)，中劑量(5.7 mg/kg)，低劑量(2.9 mg/kg，)。灌胃給藥各組在給藥后 5 min、15 min、30 min、60 min、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、16 h 及 24 h，通過靜脈采血 3 ml，肝素抗凝，3 000 r/min離心20 min取血漿，－20℃保存?zhèn)溆谩Ｈ?.6 ml的犬血漿，加入1 mol/L的HCl 0.3 ml，在85～95℃下水浴2～3 min。然后加入20%的三氟乙酸沉淀，12 000 r/min離心10 min后取上清。原子吸收分光光度法測其A值。

1.5 數(shù)據(jù)處理 本次試驗藥代動力學參數(shù)的計算采用 drug and statistics for windows(DAS，2.0 版)藥代動力學數(shù)據(jù)處理軟件，根據(jù)非房室模型對數(shù)據(jù)結(jié)果進行分析處理。

2 結(jié)果

2.1 標準曲線及線性 用原子吸收分光光度法測定犬血漿中的鐵濃度時，當鐵濃度在0.2～5 μg/ml范圍內(nèi)時線性良好，標準曲線的相關(guān)系數(shù) r=0.999 6 ～0.999 9，定量限為 0.2 μg/ml。

2.2 精密度考察 測得玉米多糖的低、中、高三種質(zhì)量濃度分別為 5.0、1.0 和 0.2 μg/ml時，用原子吸收分光光度法測得的日內(nèi)精密度分別為:0.36%、1.68% 和 10.40%;日間精密度分別為:3.98%、6.94%和 14.32%;提取回收率分別為 109.05%、108.12%、91.60%。回收率與精密度均良好，符合國家對生物樣品測定的要求。結(jié)果見表1。

表1 玉米多糖鐵的平均回收率及精密度(n=5)Tab 1 Precision and recovery rate for CPIC

2.3 穩(wěn)定性考察 表2為室溫放置24 h、－20℃保存以及反復(fù)凍溶條件下穩(wěn)定性考察的實驗結(jié)果，結(jié)果表明，多次測定樣品的準確度均在89.6% ～102.8%，說明樣品含量沒有發(fā)生明顯的變化，在冷凍放置、凍融、以及處理后室溫放置的條件下，樣品較穩(wěn)定。

表2 玉米多糖鐵的穩(wěn)定性實驗結(jié)果Tab 2 Stability for corn PIC

2.4 多糖鐵在犬中藥代動力學試驗結(jié)果 玉米多糖鐵在畢格犬體內(nèi)的血藥濃度與時間曲線見圖1，玉米多糖鐵的藥代動力學參數(shù)見表3。由圖表比較可以看出，口服灌胃給藥后，玉米多糖鐵在畢格犬內(nèi)的藥代動力學行為符合二房室模型特征，玉米多糖鐵在畢格犬體內(nèi)的末端消除半衰期Tz1/2在高、中、低劑量時分別為(1.69 ±0.25)×103、(1.4 ±0.51)×103和(1.88 ±1.41)×103min;AUC0－∞分別為(5.87 ±1.39)×103、(4.53 ±1.11)×103和(3.91 ±2.12)×103mg/(L·min)。AUC0－∞與劑量間呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù) r=0.9994(P ＜0.05，t=8.27)。且t1/2、tmax和MRT等參數(shù)不隨給藥劑量的增加而改變。表明玉米多糖鐵在犬體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄均為一級動力學過程，玉米多糖鐵的吸收、消除速率呈現(xiàn)為劑量非依賴性。

表3 畢格犬灌胃給予不同劑量的多糖鐵后的藥代動力學參數(shù)Tab 3 Pharmacokinetic parameter for corn PIC in different dosage

圖1 畢格犬給予不同劑量多糖鐵后其血漿中鐵濃度-時間關(guān)系曲線Fig 1 Concentration and time curve for corn PIC administered by different dosage in the beagle dogs

3 討論

近年來多糖鐵復(fù)合物在缺鐵性貧血的臨床應(yīng)用中越來越廣泛，其中，力蜚能是多糖鐵復(fù)合物產(chǎn)品中臨床療效非常成熟的進口補鐵劑，多項研究證明［11］其補鐵療效好，生物利用度高。為了開發(fā)出更多療效好的補鐵劑，研究人員以多種生物作用多樣的大分子多糖為配體，合成各種多糖鐵，目前，對于多糖鐵的制備工藝研究很多，而對于多糖鐵的吸收利用研究則很少。本項目組以含鐵量較高的玉米多糖鐵為研究對象，考察其在大鼠，畢格犬體內(nèi)的藥代動力學過程，并以力蜚能為對照，考察其在犬體內(nèi)的生物等效性。研究結(jié)果表明，玉米多糖鐵在畢格犬體內(nèi)的藥代動力學參數(shù)符合二房室模型特征，其末端消除半衰期Tz1/2與劑量呈現(xiàn)正相關(guān)。但 t1/2、tmax和MRT等藥代動力學參數(shù)隨劑量的增加無明顯變化，其吸收、消除速率為劑量非依賴性。另外，生物利用度研究表明［12］，玉米多糖鐵的相對生物利用度為107.698%，與力蜚能具有生物等效性，是一種在臨床上極具應(yīng)用前景的補鐵劑，可大大改善目前臨床上對進口補鐵劑過度依賴的局面。

比較玉米多糖鐵在大鼠和畢格犬體內(nèi)的藥代動力學參數(shù)發(fā)現(xiàn)，玉米多糖鐵在大鼠和畢格犬中的達峰時間差異巨大，大鼠給藥后1～1.5 h時血藥濃度達到峰值［13］，而畢格犬在給藥后約4 h血藥濃度才達到峰值。這表明不同物種的動物對鐵的吸收速度有明顯的差異。而且即使是同種動物，給藥后的峰濃度差異也比較大，可能的原因是鐵的吸收與實驗動物的狀態(tài)有關(guān)。同時，實驗結(jié)果表明，玉米多糖鐵在大鼠和畢格犬中吸收和消除速度差異很大，這可能是由種屬差異造成的。研究玉米多糖鐵在不同種屬的藥代動力學差異可以有助于更加透徹的闡明玉米多糖鐵的藥效學和毒理學，并可以為玉米多糖鐵今后的臨床應(yīng)用提供實驗參考數(shù)據(jù)。

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