劉 剛 , 郇 聘 劉保忠

(1. 中國科學院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

軟體動物是僅次于節(jié)肢動物的第二大多細胞動物門, 形態(tài)、顏色各異的貝殼是除頭足類的大多數軟體動物最顯著的特征。鑒于貝殼在該類物種中的重要作用, 圍繞貝殼發(fā)生、鈣化機制等的研究一直是熱點問題[1-5]。貝殼的發(fā)生起始于胚胎發(fā)育早期[6-7]。在原腸作用還未開始或剛開始時, 胚胎背部細胞開始變形、內陷, 其范圍逐漸擴大。與此同時, 內陷的細胞開始分泌貝殼物質, 形成貝殼。早期貝殼繼續(xù)擴大,逐漸包裹整個幼蟲; 與此同時, 碳酸鈣開始沉積, 雙殼類中形成鉸合部而將貝殼分為兩片。至D形幼蟲時期, 貝殼發(fā)育較完善, 已經完全鈣化且可以包裹整個幼蟲, 稱作Ⅰ期胚殼。

目前的研究表明, 在貝殼發(fā)生的過程中 dpp基因發(fā)揮了重要的調控作用, 可能調控了新生貝殼的發(fā)生時間、形狀等關鍵方面。dpp基因屬于轉化生長因子β超家族(TGF-β)骨形成蛋白(BMP)家族的分子,在序列上與哺乳動物BMP2/4同源[8]。在模式生物中的研究還表明, dpp基因在體軸決定(背腹軸)和附肢發(fā)育中發(fā)揮重要作用[9-12]。

作為世界范圍內的重要經濟貝類, 長牡蠣(Crassostrea gigas)是貝類研究的模式種之一。作者鑒定了一種長牡蠣 dpp基因, 研究了該基因在胚胎發(fā)育早期的時空表達情況, 證實了其參與貝殼的發(fā)生過程; 同時作者的結果與前人報道亦有差別, dpp在貝殼鉸合部發(fā)生中的功能可能有待進一步確認。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與幼蟲培養(yǎng)

性成熟的長牡蠣購自青島市水產市場, 解剖后取精子和卵細胞, 使其在海水中受精。受精卵在25℃水溫下發(fā)育, 持續(xù)充氣。分別取卵細胞、胚胎及擔輪幼蟲等樣品, 經 4%多聚甲醛固定后梯度甲醇脫水,保存于–20℃中備用。

1.2 長牡蠣dpp基因的克隆

首先從牡蠣EST數據庫搜索得到一條dpp同源序列HS140609。HS140609來自于cDNA克隆的3′測序, 比對到dpp基因的3′端。分別以該cDNA克隆的 5′和 3′EST 序列(HS140608 和 HS140609)設計了引物cgdpp-F1(TACACACGGGATTATTTACT)和cgdpp-R1(CGCAAATAAATAATATCACA), 從長牡蠣幼蟲cDNA中成功獲得了長牡蠣的 dpp同源基因的全長cDNA序列, 命名為cgdpp。

1.3 序列特征和進化分析

通過生物信息學工具分析了 cgdpp編碼的氨基酸序列的一些特征: 利用 Expasy 網站提供的工具(http: //web.expasy.org/compute_pi/)預測了分子量和等電點; 利用 SignalP網站工具預測了信號肽序列(www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/); 利用 NCBI的CDD數據庫檢索了cgdpp中的保守結構域情況(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)。通過比較cgdpp編碼蛋白序列與其他種屬動物dpp同源序列的比較, 以 Neighbor-Joining方法構建了進化樹[13]。

1.4 整裝原位雜交

整裝原位雜交使用的探針選擇了部分 ORF序列,利用引物 cgdpp-F2(TTCTCTGGGAGAGAGCGTCA)和 cgdpp-R2(CTACCGGCAACCACAGCCTTC)擴增得到 PCR產物后, 連接入 pGEM-T載體(Promega),克隆入大腸桿菌(DH5α)內增殖。質粒經酶切線性化后作為模板, 以T7或SP6 RNA聚合酶體外轉錄合成RNA; 使用DIG RNA Labeling Mixture試劑盒(Roche)以獲得地高辛標記RNA探針。利用正義RNA探針作為陰性對照, 在卵細胞, 各時期胚胎及擔輪幼蟲、D形幼蟲中進行整裝原位雜交以研究 cgdpp的時空表達規(guī)律。整裝原位雜交的流程按照Maures[14]報道的方法進行。

2 結果

2.1 cgdpp基因

擴增得到的cgdpp基因cDNA全長1448bp, 包括 131bp的 5’UTR, 1257bp的編碼序列(ORF)以及60bp的 3’UTR, 編碼一個含 418個氨基酸的前體蛋白, 其理論分子量為 48.09 kDa, 理論等電點 9.59。該序列已提交至 GenBank(Accession No. KC56-1778)。其中第 1～20個氨基酸被預測為信號肽序列(SP), 保證新生蛋白進入內質網-高爾基體以接受必要的翻譯后修飾, 如糖基化等。在距離C端106～146個氨基酸處長達30個氨基酸的序列中有眾多的位點符合 R(K)-X-X-R(K)的序列, 它們都是潛在的蛋白酶作用位點(圖1)[15]。在距C端105個氨基酸之內的成熟肽部分有 7個半胱氨酸殘基, 在人 BMP2和Cgdpp中保守存在, 參與形成必要的分子內二硫鍵。整個分子的結構見圖1。

圖1 Cgdpp前體蛋白的結構Fig.1 A scheme of Cgdpp

2.2 進化分析

基于 cgdpp所編碼的氨基酸序列及其他物種的同源序列, 構建了系統(tǒng)進化樹(圖2)。cgdpp首先和其他兩種雙殼貝類的的 dpp基因聚為一支, 再與腹足類的dpp基因形成軟體動物分支; 人(Homo sapiens)、鼠(Rattus norvegicus)、斑馬魚(Danio rerio)等的BMP2和 BMP4則形成脊椎動物分支; 果蠅(Drosophila melanogaster)等節(jié)肢動物形成節(jié)肢動物分支;線蟲則單獨占據一個分支。

2.3 cgdpp在長牡蠣早期發(fā)育中的時空表達分析

圖2 cgdpp的進化分析, 節(jié)點處的數值表示1000次重復抽樣所得的bootstrap值Fig.2 A phylogenetic tree of dpp-homologs constructed through the Neighbor-Joining method. The bootstrap values were calculated from 1000 replicates

利用整裝原位雜交技術在長牡蠣卵細胞、受精卵至受精后14 h(14 hours post fertilization, 14 hpf)內的數個時間點研究了長牡蠣 cgdpp的表達情況(圖3)。在卵細胞及4細胞時期(2 hpf)未能檢測到cgdpp表達。自4 hpf起, cgdpp開始在胚胎背部的兩個細胞中表達, 這種表達模式一直保持到原腸胚時期(8 hpf); 同時在這兩個細胞周圍逐漸出現一些較弱的表達。值得注意的是, 隨著貝殼發(fā)生區(qū)自 6 hpf起變得明顯,cgdpp的表達部位很清晰地被定位于正在發(fā)生中的貝殼的上下兩端。在擔輪幼蟲中(11 hpf), cgdpp的表達區(qū)域發(fā)生變化, 由貝殼中部的上下兩端演變?yōu)檠匦律悮さ倪吘壏植?貝殼兩側的信號不甚清晰)。在擔輪幼蟲后的早期D形幼蟲中(14 hpf), 整個幼蟲都能檢測到微弱的 cgdpp表達, 但是沒有明顯的集中部位, 似乎是廣泛表達的。為了更清晰地展示cgdpp在貝殼發(fā)生過程中的表達模式, 作者在圖 4中展示了在原腸胚(8hpf)和擔輪幼蟲(11hpf)中貝殼形成區(qū)與cgdpp的表達區(qū)域間的關系。

3 討論與結論

作者從長牡蠣幼蟲cDNA中克隆到了dpp同源序列cgdpp, 其序列具有TGF-β家族的諸多特征, 如信號肽序列, 保守的功能域, 蛋白酶切割位點等。值得關注的是在成熟肽部分的 7個保守的半胱氨酸殘基, 在人類BMP2和cgdpp中毫無變化, 說明這些殘基在進化過程中承受了巨大的選擇壓力, 其突變可造成巨大的影響(可能是致死的)。此外, 在距 C端105個氨基酸范圍內并沒有發(fā)現其他的半胱氨酸殘基, 這表明可能除了在進化中保守的二硫鍵外,cgdpp中并沒有其他的二硫鍵存在。

進化分析表明各物種的 dpp依其種屬來源聚在一起, 說明從整體序列上來看不同的種類間具有一定的差異, 暗示 cgdpp的部分序列可以在進化中積累變異。這些序列可能來自功能氨基酸之間連接的部分, 這與在多序列比對過程中發(fā)現這些部分保守性較差的觀察結果一致。另外, 軟體動物和脊椎動物在各自聚成一支后又一起形成了更大的一個分支(圖2), 這與其種屬關系并不一致。作者觀察到這個大分支的 bootstrap值相對比較低(只有 45), 可信度遠不及其他分支, 推測這種現象可能是由于 cgdpp中的部分序列, 如蛋白切割位點及成熟肽部分比較保守導致的。

作者用整裝原位雜交的方法研究了 cgdpp在長牡蠣由卵細胞、受精卵至早期D形幼蟲中的表達情況, 其結果對于研究cgdpp的功能具有啟示意義。首先, 在卵細胞中未能檢測到cgdpp表達, 說明cgdpp并不是母體效應基因, 這與 Kin等[16]在刺牡蠣(Saccostrea kegaki)中的觀察一致。受精后的一段時間內(4hpf到8hpf), 貝殼形成區(qū)變平、內陷繼而擴張,為后續(xù)貝殼物質的分泌和最早期貝殼的形成做準備。在此期間, cgdpp在開始并在較長時間內表達于胚胎背部的兩個細胞中。Ninov等[17]的相關研究中揭示, dpp信號通路可以直接調控細胞的運動性和內陷,作者認為 cgdpp應該也調控了長牡蠣胚胎背部細胞的變形和內陷等運動過程。此外, 在運動過程中, 顯然這些細胞還發(fā)生了分化, 由普通的外胚層細胞獲得了分泌貝殼物質的能力。這些細胞分化過程也應該有 dpp信號通路的參與, 正如果蠅翅形成過程中前后端細胞的分化過程一樣[18]。除此之外, 考慮到dpp在體軸決定中的重要作用[8,12], cgdpp表達于背部細胞中也提示 dpp信號通路可能控制了長牡蠣早期體軸決定過程中的背部化過程。

在擔輪幼蟲之后, 隨著貝殼形成區(qū)的擴張,cgdpp的表達由兩個細胞擴展到貝殼外邊緣的一系列細胞中, 與貝殼的形狀一致(圖 3、圖 4), 提示cgdpp調控了貝殼的形狀和形成速度。這與Nederbragt等[2]在一種腹足類(Patella vulgata)貝殼發(fā)生過程中的觀察結果相同。Nederbragt等還觀察到dpp和engrailed在P. vulgata的貝殼發(fā)生過程中各自形成一個表達界面。他們認為, 與果蠅翅的發(fā)生等許多發(fā)育事件相同, dpp和engrailed形成的表達界面界定了貝殼形成細胞與其他普通外胚層細胞的區(qū)別。在長牡蠣中可能也存在類似的過程, 如果后面的研究中能夠將長牡蠣dpp和engrailed基因同時定位應該能夠解答這個問題。在早期D形幼蟲中, cgdpp表達量突然下降至痕量水平, 并與貝殼發(fā)育區(qū)無明顯的關聯(lián), 提示cgdpp可能僅僅參與了貝殼的發(fā)生, 不參與其進一步的發(fā)育過程。長牡蠣幼蟲貝殼的發(fā)育可能是一個正反饋的調節(jié)過程, 其形成過程一旦起始, 則可以自發(fā)進行下去, 其起始信號(如Dpp等)不是維持其發(fā)育的必要條件。

圖3 長牡蠣cgdpp的在早期發(fā)育中的表達情況Fig.3 Expression pattern of cgdpp mRNA during early development of C. gigas

圖4 長牡蠣cgdpp在原腸胚(8 hpf)和擔輪幼蟲(11 hpf)中的表達模式Fig.4 Schemes of the cgdpp expression pattern in the gastrula (8 hpf) and trochophore (11 hpf) of C. gigas

Kin等[16]在刺牡蠣中研究了 dpp基因的表達情況, 其結果與作者的觀察大部分一致, 但有一個十分關鍵的不同點。在擔輪幼蟲向D形幼蟲發(fā)育的過程中, Kin認為cgdpp表達于新生的鉸合部, 在參與鉸合部形成的同時還調控了其形狀。但是作者的觀察結果與其完全不同, 并沒有明確地觀察到 cgdpp在鉸合部的表達, 而是與之前的在腹足類的觀察類似, 即在新生貝殼的外緣觀察到cgdpp的mRNA。這種差別可能是由于貝類幼蟲在顯微鏡下不易分辨而導致的觀察上的差異。采用更加精準的觀察手段, 如激光共聚焦顯微鏡或者電子顯微鏡等或許可以給出更加確定的結果。

總之, 在早期發(fā)育中長牡蠣胚胎通過細胞運動和細胞分化過程形成了貝殼形成區(qū), 為早期貝殼提供了結構基礎, cgdpp作為重要的調控分子可能涉及其中。正如絕大多數發(fā)育事件一樣, 當中必然還涉及到其他調控分子與 cgdpp協(xié)同作用, 這些調控分子是下一步研究中的重要研究目標。

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