許愛斌，劉建國(guó)，張健，李俊峽

心肌缺血是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┑幕静±砩磉^程，有效地恢復(fù)缺血心肌的再灌注，是治療的最根本措施[1]。但恢復(fù)正常的血流灌注，缺血區(qū)的損傷反而加重并引發(fā)心肌缺血/再灌注（myocardial ischemia/reperfusion，MI/R）損傷[2]。MI/R損傷是冠心病患者致死致殘相關(guān)的一個(gè)主要因素[3]。如何減輕甚至消除MI/R損傷，是目前冠心病血管再通治療急需解決的難題。臨床上一直在尋找治療MI/R損傷的藥物，而中草藥能夠有效治療冠心病，改善心肌缺血損傷，如丹紅注射液[4]，同時(shí)這些中草藥相對(duì)副作用較小。紅花是丹紅注射液的重要成分，紅花功能主治是活血化瘀，而紅花黃素是其水提取物，羥基紅花黃素A（hydroxysafflor yellow A，HSYA）是其主要藥效成分[5]。但是，對(duì)于其改善心肌缺血的具體機(jī)制尚不明確。本研究擬建立大鼠MI/R損傷模型，并探討HSYA對(duì)缺血損傷心肌的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 Sprague Dawley（SD）大鼠30只，清潔級(jí)，體重（200±20）g，雌雄各半，許可證號(hào)：SCXK-（軍）2007-007，購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。清潔級(jí)飼養(yǎng)，正常飼養(yǎng)，術(shù)前12 h禁食，自由飲水。

1.2 藥物 HSYA購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所（批號(hào)：111637-200905）。

1.3 主要試劑與儀器 肌酸激酶同工酶（CKM B），肌鈣蛋白I（c T n I），白介素-1（IL-1），白介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子（TNF-α）酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（sigma，美國(guó)）；氯化三苯基四氮唑，伊文思藍(lán)（碧云天，中國(guó)）。HX-100E小動(dòng)物呼吸機(jī)（成都泰盟科技），恒溫?fù)u床（上海?，敚?，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（TECAN）。

1.4 模型建立 造模方法參考文獻(xiàn)[6]，實(shí)驗(yàn)大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉2 ml/kg麻醉，仰臥位固定，連接Ⅱ?qū)?lián)心電圖監(jiān)測(cè)，暴露氣管，分離左頸總動(dòng)脈并進(jìn)行插管，打開胸腔，暴露心臟，以左心耳與肺動(dòng)脈圓錐交界處的左冠狀動(dòng)脈前降支為標(biāo)志，于左心耳下方1～2 mm處進(jìn)針、穿線（橫跨左冠狀動(dòng)脈前降支），將一小硅膠管從絲線兩端穿入，穩(wěn)定10 min后結(jié)扎，缺血30 min后，再灌注3 h結(jié)束。假手術(shù)組動(dòng)物只穿線不結(jié)扎。成功標(biāo)準(zhǔn)：結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支后，心電圖Ⅱ?qū)?lián)ST段弓背向上抬高，T波高聳，肉眼觀察結(jié)扎線下心肌組織顏色呈蒼白色為缺血成功；放松結(jié)扎線后，以抬高的ST段下降1/2以上為再灌注成功。

1.5 分組 本實(shí)驗(yàn)將 SD 大鼠隨機(jī)分為 3 組：假手術(shù)組（Sham組）、模型組（MI/R組）、HSYA治療組（MI/R+ HSYA組）。再灌注即刻給藥，直接注射到分離出來的冠狀動(dòng)脈中。MI/R組注射生理鹽水，MI/R+ HSYA注射5 mg/kg HSYA。假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)

1.6.1 心肌梗死測(cè)量 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后頸靜脈注射伊文思藍(lán)（Evans Blue，EB）（5 g/L）2 ml，30 min 后打開胸腔，取出心臟，生理鹽水充分洗凈殘血，濾紙吸干，剪去血管、結(jié)締組織、心房和右心室，留下左心室。將左心室置于-20℃冰箱冷凍30 min，平行房室溝將其切成5-8片，每片厚1～2 mm。切片置于 1%氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chloride，TTC）中 37℃孵育15 min，隨后用多聚甲醛固定，正常心肌組織染成藍(lán)色，缺血心肌組織染成紅色。Image ProPlus圖像分析：將切片展開平鋪于載玻片上，采用數(shù)碼相機(jī)拍攝，導(dǎo)出的照片利用圖像分析軟件Image ProPlus 進(jìn)行梗死面積的計(jì)算。公式如下所示：梗死區(qū)面積（infarct zone, IZ%）= 梗死區(qū)/（梗死區(qū)＋缺血區(qū)）×100%。危險(xiǎn)區(qū)面積（risk zone，RZ%）=（梗死區(qū)＋缺血區(qū)）/除去左心室的心肌面積×100%。

1.6.2 HE染色 實(shí)驗(yàn)結(jié)束取大鼠心尖處組織一小塊，用 4℃生理鹽水沖洗干凈，將標(biāo)本放入4%多聚甲醛中固定24～72 h，依次經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明之后進(jìn)行石蠟包埋，切片HE染色。

1.6.3 血流動(dòng)力學(xué)及心電圖檢測(cè) SD大鼠被麻醉之后，電極位置參照ECG導(dǎo)聯(lián)的標(biāo)準(zhǔn)，用針電極插入大鼠四肢皮下相應(yīng)部位。測(cè)定左心室收縮壓（LVSP）、左心室舒張末壓（LVEDP）、收縮壓最大上升速率（+dp/dt max）及舒張壓最大下降速率（-dp/dt max）等心功能指標(biāo)。

1.6.4 CK-MB和cTnI檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)從SD大鼠頸動(dòng)脈取血，后室溫靜置20 min，3500轉(zhuǎn)離心12 min后取血清，按照所購(gòu)試劑盒的說明書嚴(yán)格操作，檢測(cè) CK-MB和cTnI。

1.6.5 炎癥因子檢測(cè) 按照所購(gòu)試劑盒的說明書，檢測(cè)血清IL-1、IL-6 和 TNF-α含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，三組間均數(shù)比較采用方差分析，組間均數(shù)比較運(yùn)用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心肌梗死面積觀察 各處理組大鼠心肌危險(xiǎn)區(qū)（risk zone，RZ）及梗死區(qū)（infarct zone，IZ）的數(shù)據(jù)如圖1。各處理組危險(xiǎn)區(qū)沒有顯著性差異（P=0.27）。MI/R組大鼠心肌梗死百分比達(dá)（43.26±10.09）%，而MI/R+HSYA組梗死面積顯著低于MI/R組（27.34±7.83）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 組織學(xué)觀察 假手術(shù)組心肌纖維排列整齊，心肌細(xì)胞形態(tài)均一，MI/R組心肌纖維紊亂，細(xì)胞形態(tài)混濁腫脹，并有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，MI/R+HSYA組顯著減輕心肌損傷，纖維結(jié)構(gòu)與Sham組類似（圖2）。

2.3 血流動(dòng)力學(xué)及心電圖監(jiān)測(cè)結(jié)果 缺血30 min和再灌注3 h的各組大鼠心功能指標(biāo)的變化如表1所示。在測(cè)量的不同時(shí)間點(diǎn)，MI/R組的LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax及HR均較Sham組降低（P＜0.05）。給予HSYA治療后，以上參數(shù)均較MI/R組升高（P＜0.05）。

圖1 HSYA減少M(fèi)I/R大鼠心肌梗死面積（與MI/R組比較，**P＜0.05）

圖2 HSYA改善MI/R大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)

2.4 心肌損傷標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果 圖3所示各處理組大鼠血清中CK-MB、cTnI的濃度。MI/R組SD大鼠血清中CK-MB和cTnI的濃度均顯著高于Sham組（P＜0.05），HSYA治療組CK-MB和cTnI水平較MI/R組顯著降低（P＜0.05）。

2.5 對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷后炎癥因子的影響 圖4所示為各組大鼠血清中IL-1、IL-6及TNF-α濃度。MI/R組SD大鼠血清中IL-1、IL-6及TNF-α的濃度顯著高于Sham組（P＜0.05），MI/R+HSYA組 IL-1、IL-6及TNF-α水平較 MI/R組有所降低（P＜0.05）。

3 討論

圖4 HSYA降低MI/R大鼠血清中IL-1、IL-6和TNF-α水平（與Sham組比較，##P＜0.05；與MI/R組比較，**P＜0.05）

冠心病尤其是急性心肌梗死嚴(yán)重危害著患者的健康和生命，目前臨床上內(nèi)科治療主要是采取冠狀動(dòng)脈球囊擴(kuò)張和支架置入的方法，外科采取冠脈旁路移植的方法，經(jīng)過治療后，及時(shí)再通堵塞的冠狀動(dòng)脈，使心肌重新獲得血液提供的營(yíng)養(yǎng)和氧分[7]。但是MI/R損傷日益受到心臟病學(xué)家的高度關(guān)注[8]。本實(shí)驗(yàn)在大鼠缺血再灌注模型中研究中藥丹參紅花配方中的藥效成分之一HSYA，探討其對(duì)缺血再灌注損傷的改善有無(wú)影響。

臨床上，MI/R導(dǎo)致的梗死面積大小通常被用來評(píng)價(jià)損傷的嚴(yán)重程度[9]。本實(shí)驗(yàn)通過EB/TTC染色計(jì)算出各組的梗死面積大小，結(jié)果顯示HSYA能減少梗死面積，說明其對(duì)MI/R損傷有一定的保護(hù)作用，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[10]。

血清檢測(cè)指標(biāo)心肌損傷標(biāo)志物是臨床上診斷心肌損傷的常用指標(biāo)，其中CK-MB被認(rèn)為是急性心肌梗死的重要診斷指標(biāo)之一[11]。cTnI是一種心肌收縮調(diào)節(jié)蛋白，對(duì)心肌損傷比其他心肌酶類更具高敏感性和高特異性[12]。本實(shí)驗(yàn)中在給予HSYA治療的大鼠血清中檢測(cè)到的上述兩種心臟標(biāo)志物的含量均要降低，說明HSYA能降低MI/R損傷，這與大體結(jié)果的梗死面積縮小是一致的。

MI/R損傷使得缺血心肌無(wú)法通過目前的再灌注療法獲得最佳療效，研究如何預(yù)防或減輕再灌注損傷己成為當(dāng)前冠心病治療的熱點(diǎn)問題[13]。目前關(guān)于MI/R研究很多，認(rèn)為導(dǎo)致MI/R 損傷的主要機(jī)制包括：氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、鈣離子超載、能量代謝障礙等等，IL-1、IL-6 及TNF-α是炎癥過程中起重要作用的細(xì)胞因子，在損傷的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[14]。但關(guān)于HSYA對(duì)MI/R過程中的炎癥有無(wú)抑制作用尚未明確。本研究檢測(cè)到HSYA治療組的IL-1、IL-6 及TNF-α均有所降低，這說明其可能使通過抑制MI/R 損傷過程中產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)來發(fā)揮心肌保護(hù)作用的。

本研究發(fā)現(xiàn)，HSYA可明顯減少M(fèi)I/R 損傷后的心肌梗死面積，同時(shí)對(duì)心肌缺血和梗死引起的CK-MB和cTnI釋放有明顯的抑制作用，明顯改善心功能。HSYA對(duì)心肌的保護(hù)作用可能主要是通過抑制炎癥因子的釋放，從而達(dá)到增加心肌血流量，改善心肌氧代謝，減少M(fèi)I/R損傷。

表1 HSYA改善MI/R大鼠心功能

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