周 穎，張 輝，謝永紅，趙 敏，沈 彥，尹端端

0 引 言

缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)是近年發(fā)現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)錄因子，已有研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α在肺癌、乳腺癌等多種腫瘤組織中過度表達(dá)。p-糖蛋白(p-glycoprotein，p-gp)介導(dǎo)的多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)在人類腫瘤中具有普遍性，由MDR/p-gp介導(dǎo)的耐藥機(jī)制在非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)中亦占有重要地位。人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是一種DNA病毒，感染人和動(dòng)物的皮膚或黏膜可引起增殖性損傷。近年來，越來越多的國(guó)內(nèi)外臨床和實(shí)驗(yàn)室研究檢測(cè)出肺癌患者攜帶HPV［1-2］，尤其是HPV 16、18型。HPV感染與肺癌的關(guān)系，目前說法不一，肺癌中HIF-1α、p-gp與HPV感染的關(guān)系亦報(bào)道較少。本研究通過研究NSCLC中HIF-1α和p-gp的相關(guān)性，探討HIF-1α和p-gp在NSCLC發(fā)生發(fā)展及MDR中的作用，并初步分析其與HPV感染的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集我院2012年1-5月NSCLC患者的手術(shù)標(biāo)本60份作為NSCLC組，患者中男46例，女14例;鱗癌42例，腺癌18例;高分化12例，中分化29例，低分化19例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例;有吸煙史43例，無吸煙史17例。另以20份肺良性病變組織作為對(duì)照，其中包括肺結(jié)核6份，炎性假瘤5份，硬化性血管瘤4份，肺大皰4份，支氣管擴(kuò)張1份。標(biāo)本取材后，部分置-20℃保存，部分中性甲醛固定，石蠟包埋。

1.2 HPV PCR 檢測(cè)

1.2.1 引物 選用分別用來擴(kuò)增HPV16、18型的特異性引物2對(duì)。HPV16E6正義鏈:5'-CTGCAAGCAACAGTTACTGCGACG-3'，反義鏈:5'-CATACATCGACCGGTCCACC-3'，長(zhǎng)度 315 bp;HPV18E7 正義鏈:5'-GAGCCGAACCACAACGTCAC-3'，反義鏈:5'-GGATGCACACCACGGACACA-3'，長(zhǎng)度152bp。引物均由北京奧科生物公司合成。

1.2.2 組織DNA的提取 取適量?jī)龃娼M織，加提取緩沖液制成單細(xì)胞懸液后，沸水浴10 min，冷卻至室溫加蛋白酶K消化，酚-氯仿-異戊醇反復(fù)抽提3次，再經(jīng)100%冰冷無水乙醇沉淀、70%冰冷無水乙醇洗滌后，加 TE(10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，PH 8.0)緩沖液溶解所得DNA并4℃保存。

1.2.3 PCR擴(kuò)增反應(yīng) PCR反應(yīng)體系:每25 μL反應(yīng)體系中包含 10 × buffer 2.5 μL，20 pmol/μL 引物各 0.5 μL，Taq 酶 1 μL(1 U/μL)，Mg2+1.5 μL，dNTPs 0.5μL，去離子水16.5μL 及DNA 模板2μL。擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5min，循環(huán)特征為94℃ 45s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，共30 個(gè)循環(huán)，72℃延伸8 min。每次實(shí)驗(yàn)以不加模板為陰性對(duì)照，HPV16、18型分別用Siha和Hela細(xì)胞株DNA作陽性對(duì)照。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用加有溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠，80 V電壓下電泳約40 min，于紫外透射儀上觀察結(jié)果。

1.3 免疫組化檢測(cè)HIF-1α、p-gp的表達(dá)

1.3.1 試劑與方法 HIF-1α 抗體、p-gp抗體及通用型SP試劑盒均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司，染色步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。一抗稀釋濃度為1∶100。陰性對(duì)照用PBS代替一抗。

1.3.2 判斷標(biāo)準(zhǔn) HIF-1α陽性表達(dá)為細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃或棕褐色顆粒，p-gp陽性表達(dá)為細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃或棕褐色顆粒，顯色結(jié)果由2位病理醫(yī)師采用半定量評(píng)分系統(tǒng)獨(dú)立判定。每例均高倍鏡下(×400)隨機(jī)選擇5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，取平均值，用半定量積分法判斷結(jié)果:0分陰性;1分＜25%;2分25% ～75%;3分＞75%。陽性強(qiáng)度:1分弱表達(dá)(淺黃色);2分中等強(qiáng)度表達(dá)(棕黃色);3分強(qiáng)表達(dá)(棕褐色)。兩者積分相乘，0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(±)，4～6分為中等陽性(+)，7～9分為強(qiáng)陽性(2+)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，率的比較用χ2檢驗(yàn)及確切概率法，參數(shù)間的相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，以P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HIF-1α、p-gp的檢測(cè)結(jié)果及兩者的相關(guān)性NSCLC組中HIF-1α的陽性表達(dá)位于細(xì)胞核，陽性率為48.3%(29/60)，肺良性病變未見陽性表達(dá)(χ2=15.163，P ＜0.05)。p-gp 的陽性表達(dá)位于細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)，陽性率為60.0%(36/60)，肺良性病變組未見陽性表達(dá)(χ2=21.818，P ＜0.05)。HIF-1α陽性者中p-gp的表達(dá)率明顯高于HIF-1α陰性者，兩者呈正相關(guān)(r=0.313，P ＜0.05)。見表1。

表1 NSCLC組織中HIF-1α與p-gp表達(dá)的關(guān)系［n(%)］Table 1 Relationship between HIF-1α and p-gp expression in NSCLC n(%)

2.2 HIF-1α、p-gp表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系NSCLC組HIF-1α表達(dá)與性別、年齡、吸煙、組織學(xué)分型無關(guān)，與組織分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，高分化型HIF-1α表達(dá)率低于中、低分化型，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者HIF-1α表達(dá)率高于無轉(zhuǎn)移者，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。NSCLC組p-gp表達(dá)與性別、年齡、吸煙、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，與組織學(xué)分型相關(guān)，肺腺癌表達(dá)率高于肺鱗癌，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 NSCLC組織中HIF-1α、p-gp表達(dá)、HPV感染與臨床病理特征的關(guān)系［n(%)］Table 2 Relationship between HIF-1α，p-gpexpression，HPV infection and clinicopathological data in NSCLC n(%)

2.3HPV DNA的PCR檢測(cè)結(jié)果及與臨床病理特征的關(guān)系 NSCLC組 HPV DNA檢出率為41.7%(25/60)，肺良性病變組5.0%(1/20)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.193，P ＜0.05);HPV16、18 型特異性引物分型檢測(cè)，HPV16 型12例，檢出率為48.0%(12/25)，18 型13例，檢出率為52.0%(13/25)。NSCLC組 HPV感染與性別、年齡、吸煙、組織學(xué)分型無關(guān)，與組織分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。高分化型HPV DNA檢出率低于中、低分化型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者HPV DNA檢出率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖1。

圖1 PCR檢測(cè)HPV16、18型DNA擴(kuò)增結(jié)果電泳圖Figure 1 Electrophoresis of HPV16/18 DNA detected by PCR

2.4 HIF-1α、p-gp的表達(dá)與 HPV感染的關(guān)系HPV DNA陽性者與陰性者間HIF-1α的陽性表達(dá)率分別為52.0%和45.7%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。HPV DNA陽性者與陰性者間p-gp的陽性表達(dá)率分別為64.0%和57.1%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。

3 討 論

HIF-1是由α、β亞單位構(gòu)成的異二聚體，其中HIF-1α受缺氧的調(diào)節(jié)［3］。缺氧是實(shí)體腫瘤微環(huán)境特征之一。在細(xì)胞缺氧時(shí)，細(xì)胞核中HIF-1α顯著增加。HIF-1α不僅調(diào)節(jié)眾多的下游基因以維持或促進(jìn)腫瘤的血管形成和腫瘤的發(fā)展，而且可反饋接受腫瘤生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的因子或缺氧環(huán)境上調(diào)表達(dá)，如此形成惡性循環(huán)促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移［4］。本研究中，HIF-1α在 NSCLC組中陽性表達(dá)率48.3%，肺良性病變組未見陽性表達(dá)，提示HIF-1α參與了NSCLC的發(fā)生發(fā)展過程。本研究結(jié)果還顯示，HIF-1α的表達(dá)與組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與 Swinson等［5］的結(jié)果基本一致。高分化型HIF-1α的表達(dá)率低于中、低分化型，推測(cè)腫瘤分化程度降低，缺氧程度明顯加重，HIF-1α表達(dá)上調(diào)，通過與缺氧反應(yīng)元件作用便利于腫瘤克服缺氧并誘導(dǎo)新生血管形成，浸潤(rùn)生長(zhǎng)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者HIF-1α的表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，其機(jī)制可能為HIF-1α通過調(diào)節(jié)其下游基因VEGF誘導(dǎo)腫瘤新生淋巴管形成，同時(shí)上調(diào)COX-2，促使癌細(xì)胞對(duì)基質(zhì)的黏附性增加，E-cadherin蛋白水平下降，使癌細(xì)胞易于轉(zhuǎn)移［6］，提示HIF-1α是NSCLC發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵步驟，并參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。

p-gp是最早發(fā)現(xiàn)和克隆的耐藥蛋白，目前認(rèn)為p-gp是一種藥物排出泵，將進(jìn)入細(xì)胞的化療藥物排出，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)化療藥物濃度降低而引起耐藥［7］。p-gp介導(dǎo)的MDR在人類腫瘤中具有普遍性［8］。本研究中，p-gp在NSCLC組中的陽性表達(dá)率60.0%，肺良性病變組未見陽性表達(dá)，且肺腺癌p-gp的表達(dá)率高于肺鱗癌，符合臨床上鱗癌比腺癌對(duì)化療藥物敏感的現(xiàn)象［9］。MDR1/p-gp是HIF-1α的一個(gè)靶基因，在MDR1/p-gp啟動(dòng)子上存在HIF-1α的結(jié)合位點(diǎn)，HIF-1α可誘導(dǎo)MDR1/p-gp的表達(dá)增加，腫瘤耐藥性增強(qiáng)。Comerford等［10］研究表明 HIF-1α可調(diào)控MDR1/p-gp，誘導(dǎo)其表達(dá)上調(diào)，且進(jìn)一步用反義寡核苷酸阻斷HIF-1α表達(dá)可導(dǎo)致MDR1 mRNA和p-gp表達(dá)下調(diào)。Waternberg等［11］在體外研究中也發(fā)現(xiàn)低氧微環(huán)境可上調(diào)p-gp表達(dá)，并需要HIF-1α參與［12］。本研究發(fā)現(xiàn)NSCLC中HIF-1α陽性者p-gp的表達(dá)率高于陰性者，兩者呈正相關(guān)，提示HIF-1α可能通過上調(diào)p-gp的表達(dá)參與NSCLC的發(fā)生發(fā)展，并共同影響腫瘤耐藥。

HPV感染是宮頸癌的主要病因，然而近年來HPV感染與肺癌的關(guān)系已經(jīng)引起人們的重視［13］。本研究證實(shí)NSCLC組HPV DNA檢出率與肺良性病變組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示 HPV感染可能是NSCLC發(fā)生的病因?qū)W因素之一。HPV感染與NSCLC患者臨床病理資料的關(guān)系目前尚未明確，本研究發(fā)現(xiàn)HPV感染與性別、年齡、吸煙、組織學(xué)分型無關(guān)，與組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。高分化型NSCLC HPV DNA的檢出率低于中、低分化型，可能是由于分化成熟的細(xì)胞退出了細(xì)胞周期，細(xì)胞不再具有分裂能力，細(xì)胞內(nèi)僅有少量病毒復(fù)制所需的復(fù)制酶。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組HPV DNA的檢出率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。Lane等［14］報(bào)道HPV陽性的腫瘤細(xì)胞株與HPV陰性的相比VEGF的表達(dá)水平普遍升高。Lopez-ocejo等［15］認(rèn)為 HPV E6可能如一些原癌基因一樣能夠使VEGF表達(dá)增強(qiáng)。VEGF不僅誘導(dǎo)血管生成，還可誘導(dǎo)腫瘤外周形成新的淋巴管，促進(jìn)癌細(xì)胞通過淋巴管轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)。由此推測(cè)HPV感染與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能存在一定的相關(guān)性。

HIF-1α與HPV感染之間的關(guān)系國(guó)內(nèi)外研究較少，其可能的聯(lián)系有:野生型P53蛋白可通過直接抑制HIF-1α轉(zhuǎn)錄活性和通過促進(jìn) mdm2介導(dǎo)的HIF-1α泛素化-蛋白酶降解2種形式抑制HIF-1α活性。而 Munger［16］報(bào)道 HPV16、18 型 E6 可以降解野生型P53蛋白。HPV DNA陽性者HIF-1α的表達(dá)率稍高于陰性者，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能由于HPV通過P53對(duì)HIF-1α的影響是有限的，兩者的關(guān)系有待今后進(jìn)一步的深入研究。HPV DNA陽性組與陰性組間p-gp的表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示HPV感染與p-gp表達(dá)之間并無直接聯(lián)系，但也可能由于實(shí)驗(yàn)的局限性影響到實(shí)驗(yàn)的結(jié)果;另外也不排除HPV感染與p-gp表達(dá)之間可能通過多因素、多途徑相互作用，兩者相互關(guān)系及可能的內(nèi)部機(jī)制有待今后深入探討。

綜上所述，HIF-1α與p-gp參與NSCLC的發(fā)生發(fā)展及MDR。共同檢測(cè)NSCLC中HIF-1α與p-gp的表達(dá)對(duì)預(yù)測(cè)化療是否耐藥、評(píng)估患者預(yù)后有一定的參考價(jià)值。HIF-1α有望成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)，通過阻斷HIF-1α從而降低腫瘤的MDR可達(dá)到治療腫瘤，提高患者生存率的目的。

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