劉樂南，馮振華，李 潔，戴毅敏，朱海燕，許碧云，周乙華，胡婭莉

0 引 言

胎兒是一個半抗原移植物，成功的妊娠要求母體免疫系統(tǒng)對其充分耐受，而最復雜、也是首當其沖的免疫反應發(fā)生在母胎界面［1］。近年研究表明，很多重要妊娠并發(fā)癥如早產(chǎn)、子癇前期等都與母胎界面局部的炎癥免疫過度激活有關［2-4］。由于人類妊娠過程中很難獲得標本以研究母胎界面局部炎癥免疫狀況，而羊水中炎癥相關的細胞因子濃度則可能成為反映母胎界面炎癥免疫狀態(tài)的窗口。為了解正常妊娠時羊水中炎性細胞因子的情況，為今后病理妊娠的研究提供參照，本研究利用高靈敏度MILLIPLEX MAP試劑及Luminex儀器對妊娠結局正常的中孕期羊水進行了主要炎性細胞因子的檢測。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2009年4月至2012年3月323例因中孕期母血清唐氏綜合征篩查高風險、孕婦高齡等原因在我院行羊膜腔穿刺的孕婦為研究對象，羊水采集孕周為18～22+6周，隨訪妊娠經(jīng)過、分娩孕周及有無胎膜早破、有無絨毛膜羊膜炎、新生兒性別、出生體重、新生兒是否有肺炎及敗血癥等內容，將胎兒染色體異常、胎兒結構異常、早產(chǎn)、多胎妊娠、有妊娠并發(fā)癥、有明顯宮內感染跡象以及穿刺前7 d內用過抗生素者排除。本研究獲得南京醫(yī)科大學鼓樓臨床學院倫理委員會批準，并獲得孕婦知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 標本采集及處理 在B超引導下經(jīng)腹羊膜腔穿刺采集羊水27 mL，其中最初2 mL棄去，20 mL用于胎兒染色體檢查，余5 mL用于本實驗。樣本離心(13000r/min、4℃、10min、離心半徑6cm)分離上清和沉淀，分別保存于-30℃。

1.2.2 細胞因子檢測方法 采用MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel(美國Merck公司)，按試劑盒說明制備10000 pg/mL標準品、高濃度和低濃度質控品及5種細胞因子混合磁珠，并將標準品以5倍稀釋以制定標準曲線，儲存標本于室溫融化并混勻，離心(13000 r/min、4℃、10 min、離心半徑6 cm)后取上清待測，將25 μL標準品、質控品及待測標本分別與25 μL預混磁珠和25 μL緩沖液混合，并置于4℃震蕩過夜。次日將反應體系置于磁板上，清洗反應體系后，先加入25 μL檢測抗體于室溫震蕩反應1 h，再加入25 μL顯色劑于室溫震蕩反應30 min，再次將反應體系置于磁板上，清洗反應體系后加入150 μL鞘液并使用Luminex公司液相芯片分析系統(tǒng)進行細胞因子的定量分析。每個樣本均采用復孔，結果取平均值。本研究IL-10、IL-1β、IL-6、MCP-1 和 TNF-α 的靈敏度分別為0.61、0.05、0.14、0.54 和 0.25 pg/mL。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析處理數(shù)據(jù)。孕婦年齡、新生兒體重、取樣和分娩孕周均采用均數(shù)±標準差(±s)表示。對各種細胞因子水平的分布進行W檢驗，根據(jù)其非正態(tài)分布特征，各細胞因子濃度均采用中位數(shù)(M)、最小值(Min)和最大值(Max)描述，以Mann-Whitney檢驗不同胎兒性別間五種細胞因子水平比較，以Kruskall-Wallis檢驗對不同孕周和孕婦年齡間五種細胞因子水平比較。采用P 2.5～P 97.5確定細胞因子參考范圍。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

323例孕婦中6例胎兒染色體異常、13例早產(chǎn)、41例出現(xiàn)妊娠期高血壓疾病、妊娠期糖尿病等妊娠并發(fā)癥，故排除上述60例孕婦，其余妊娠結局正常的263名孕婦為最終研究對象。孕婦平均年齡(30.15±5.68)歲，平均取樣和分娩孕周分別為(20.3±1.1)周和(39.7 ±1.0)周。263 例孕婦中106名經(jīng)陰道分娩，余157名因胎位不正、頭盆不稱等原因行剖宮產(chǎn)。新生兒平均出生體重為(3.5±0.4)kg，男嬰135 名、女嬰128 名。

2.1 中孕期羊水 IL-10、IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α水平以及性別的影響 263例中孕期羊水細胞因子水平結果見表1。孕女性胎兒孕婦中孕期羊水IL-10和IL-1β低于孕男性胎兒孕婦，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。2 組間 IL-6、MCP-1 和TNF-α差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。

2.2 中孕期不同孕周對羊水 IL-10、IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α水平的影響 妊娠18～22+6周各周羊水中細胞因子的平均水平見表2。5種細胞因子各組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，IL-6水平雖然隨孕周增加而呈增高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。

2.3 孕婦年齡對中孕期羊水 IL-10、IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α水平的影響 263名孕婦按組距5歲分組，20～24歲者47名、25～29歲者95名、30～34歲者52名以及69名≥35歲的高齡產(chǎn)婦。不同年齡段孕婦各指標差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表3。

表1 中孕期不同性別胎兒孕婦羊水細胞因子比較(pg/mL)Table 1 Fetal gender and cytokines levels in amniotic fluid at mid-trimester(pg/mL)

表2 孕婦不同孕周羊水細胞因子水平［M(Min～Max)，pg/mL］Table 2 Cytokines in amniotic fluid at the 18th-22ndgestational week(M［Min-Max］，pg/mL)

表3 孕婦年齡與細胞因子水平［M(Min～Max)，pg/mL］Table 3 Maternal age and cytokines levels in amniotic fluid at mid-trimester(M［Min-Max］，pg/mL)

3 討 論

細胞因子是維持機體正常免疫功能的重要成份，反映了機體全身或局部炎癥免疫的狀態(tài)。妊娠后，在母胎界面除母體的免疫細胞外，子宮蛻膜細胞和滋養(yǎng)細胞也能合成相關細胞因子，為胎盤著床、母體免疫耐受形成、維持胎兒宮內生長發(fā)育提供必要的條件［5］。有研究表明，中孕期羊水中炎癥相關細胞因子增高可能與很多妊娠并發(fā)癥相關［6-11］，但對于正常妊娠中期羊水中細胞因子水平并不十分了解。

3.1 影響羊水中炎性細胞因子濃度的因素 本研究發(fā)現(xiàn)孕男性胎兒孕婦的中孕期羊水中IL-10和IL-1β水平略高于孕女性胎兒孕婦。提示男性胎兒母胎界面局部炎癥反應可能比女性胎兒激烈。因本研究的研究對象均為正常妊娠結局者，故尚不能說明上述因子增高有何臨床意義。

妊娠過程中羊水成分在不斷變化，高齡孕婦相對適齡孕婦發(fā)生妊娠并發(fā)癥的風險也在增加，因此本研究就孕齡及孕婦年齡對細胞因子水平的影響做了研究。結果顯示胎兒性別及孕婦年齡、孕齡均不影響IL-6、MCP-1、TNF-α的水平，與既往研究結果一致［12-13］。提示此3種因子在中孕期羊水中的穩(wěn)定性及作為預測不良妊娠結局指標的獨立性。

3.2 與既往研究中孕期羊水 IL-10、IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α檢測水平的比較 本研究正常孕婦中孕期羊水中5種細胞因子檢測水平與其他研究結果差異較大。Perni等［14］使用ELISA檢測結果顯示IL-1β和IL-6水平分別約是本研究結果的17倍和7倍，但TNF-α水平卻較本研究結果低。而本研究結果顯示 IL-1β、IL-6和 TNF-α 水平均低于 Chow等［12］使用Bio-Plex細胞因子檢測試劑盒檢測結果，但Chow等［12］研究結果中IL-1β和IL-6水平仍明顯低于Perni等［14］研究結果。即使是同一國家，其檢測水平也存在明顯差異［14-15］。不同國家地區(qū)間正常孕婦中孕期羊水中五種細胞因子檢測水平存在較大差異，這可能是因為各研究對象的人種以及檢測細胞因子水平的試劑盒等不同引起。因此，在進行相關研究時，各實驗室應根據(jù)研究對象基本特征及試劑盒的不同，設立相應對照組，確定相應的參考值。

3.3 羊水中細胞因子檢測方法 羊水中細胞因子反應了母胎界面的炎癥免疫應答，而此類炎性細胞因子并非細菌感染刺激產(chǎn)生，而主要是內源性分子刺激所致，故羊水中炎性細胞因子濃度較低，故羊水中炎性細胞因子的檢測需要靈敏度高的檢測方法。本研究采用靈敏度較高的Luminex公司液相芯片分析系統(tǒng)及MILLIPLEX MAP細胞因子檢測試劑檢測羊水細胞因子，其檢測原理為含有2種熒光染料的內在顏色編碼微磁珠，每個珠子上都包被有特異性的捕獲抗體，并通過染料的不同濃度確定不同的磁珠捕獲檢測樣本中的分析物，加入生物素標記的檢測抗體后與作為報告分子的顯色劑結合，待液相芯片分析系統(tǒng)中兩種激光分別激發(fā)磁珠內部染料及報告分子上熒光染料，高速數(shù)字信號將處理識別每個磁珠，并通過熒光報告信號即可定量生物分析的結果。這種磁珠的微小體積、液體懸浮性、快速動力學以及高面積體積比使得此試劑盒靈敏度高，且僅需50 μL樣本就可以同時檢測多種細胞因子，從而為珍貴樣本檢測提供了保障。

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