毛森林，馬翊竑，張海東，齊 軍，李 峰

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，哈爾濱150086)

腦缺血/再灌注損傷(CIR)最終會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元 凋亡［1］，凋亡的通路主要有死亡受體活化途徑(外源性途徑)、線粒體損傷途徑(內(nèi)源性途徑)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激啟動(dòng)的凋亡途徑，其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑(ERS)是目前發(fā)現(xiàn)的一種新的凋亡途徑［2，3］。有研究顯示，ERS在CIR過程中處于核心地位，預(yù)處理可以減輕組織損傷［4，5］，而上調(diào) CHOP 蛋白表達(dá)是ERS誘導(dǎo)細(xì)胞神經(jīng)元凋亡的途徑之一。有研究報(bào)道，芍藥苷(PA)不僅具有降低血黏度、抗血小板聚集、抗炎、免疫抑制及抗腫瘤等作用［6～9］，還對(duì) CIR有一定的保護(hù)功能［10］。2014年1～3月，我們觀察了PA預(yù)處理對(duì)CIR大鼠組織細(xì)胞凋亡及CHOP蛋白表達(dá)的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 SD雄性大鼠72只，體質(zhì)量(250±10)g，均來自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。水合氯醛購于 Sigma公司，DMSO購于美國Amresco公司，冰凍切片快速抗原修復(fù)液購于碧云天生物技術(shù)研究所，DAB顯色試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司，TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于德國Roche公司。

1.2 方法

1.2.1 分組預(yù)處理與造模 將72只SD雄性大鼠隨機(jī)分為預(yù)處理組、模型組、假手術(shù)組各24只。預(yù)處理組給予0.2 mg/kg PA灌胃，模型組及假手術(shù)組給予等量PBS灌胃，1次/d，連續(xù)3 d。于給藥后第4天，參照Longa等［11］的方法并加以改良，建立大鼠CIA模型。造模前禁食12 h，不禁水。預(yù)處理組、模型組根據(jù)體質(zhì)量腹腔注射水合氯醛0.3 mL/100 g，固定、備皮;后頸前正中旁開2 mm做縱行小切口，分離左側(cè)頸外動(dòng)脈(ECA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)及頸總動(dòng)脈(CCA)。結(jié)扎ECA遠(yuǎn)端，分別在ICA及CCA上放置顯微血管夾，在ECA距CCA分叉部約7 mm處剪一斜行小切口，將線栓自ECA切口插入;用電凝器將剪口處電凝處理，切斷ECA，分別松開ICA及CCA上顯微動(dòng)脈夾;調(diào)轉(zhuǎn)線栓頭端方向，將線栓在直視下插入ICA約17 mm，從而阻斷大腦中動(dòng)脈(MCA)主干血流;將大鼠切口處用紗布蘸取少量生理鹽水覆蓋，保留線栓90 min后拔出，縫合切口。假手術(shù)組僅暴露各動(dòng)脈，不做切口與線栓插入。在模型制作過程中，凡手術(shù)中動(dòng)物死亡、蛛網(wǎng)膜下腔出血或無對(duì)側(cè)偏癱體征均視為模型制作失敗，用同一批次的大鼠造模成功后補(bǔ)足數(shù)目。

1.2.2 腦組織細(xì)胞凋亡檢測 采用TUNEL法。各組分別于再灌注1(T0)、4(T1)、24(T2)h各取6只大鼠快速斷頭取腦，制作腦組織冰凍切片，片厚7 μm。4%多聚甲醛固定，PBS洗滌、孵育，加50 μL生物素標(biāo)記液，37℃孵育60 min;加0.1～0.3 mL標(biāo)記反應(yīng)終止液，室溫孵育10 min;加50 μL Streptavidin-HRP工作液，濕盒室溫孵育30 min;加0.2～0.5 mL DAB顯色液，室溫孵育;常規(guī)乙醇脫水，二甲苯透明后封片。細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)染成棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞，即為凋亡細(xì)胞。于200倍顯微鏡下隨機(jī)選取6個(gè)視野，每個(gè)視野采用IPP6.0軟件計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞。細(xì)胞凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù)×100%，取平均值。

1.2.3 腦組織CHOP蛋白檢測 采用免疫組化法。切片經(jīng)4%PFA固定20 min，30%H2O2和純甲醇以1∶50的比例固定30 min，抗原修復(fù)液修復(fù)5 min，5%BSA封閉 30 min。加 CHOP抗體(兔 IgG 1∶100)4℃過夜，及生物素化山羊抗兔IgG(1∶200)37℃孵育20 min。SABC封閉30 min后DAB顯色，常規(guī)乙醇梯度脫水，二甲苯透明，樹膠封片。以PBS代替CHOP抗體作為對(duì)照，細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色為陽性表達(dá)。顯微鏡下每張切片隨機(jī)選取6個(gè)視野進(jìn)行觀察拍照，使用IPP6.0軟件進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。CHOP蛋白表達(dá)=陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。1.2.4 神經(jīng)功能評(píng)分 每組于缺血再灌注后24 h各取6只大鼠，由不知分組情況的觀察者在相同條件下參照Bederson等［12］的方法進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分:0分:正常，未見任何神經(jīng)功能缺損表現(xiàn);1分:垂直提起時(shí)缺血對(duì)側(cè)前爪不能伸直;2分:行走時(shí)向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分:行走時(shí)身體向偏癱側(cè)傾倒;4分:不能自發(fā)行走或有意識(shí)障礙。評(píng)分為0、4分者剔除實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組腦組織細(xì)胞凋亡指數(shù)和CHOP蛋白表達(dá)比較 見表1。

2.2 各組神經(jīng)功能評(píng)分比較 預(yù)處理組神經(jīng)功能評(píng)分為(1.33 ±0.52)分，模型組(2.50 ±1.05)分，假手術(shù)組為0分;預(yù)處理組和模型組的神經(jīng)功能評(píng)分均高于與假手術(shù)組，P分別 ＜0.05、0.01;預(yù)處理組和模型組比較，P ＜0.01。

3 討論

缺血性腦卒中是由各種原因所致急性腦動(dòng)脈血液供應(yīng)障礙，導(dǎo)致腦組織缺血缺氧性壞死，出現(xiàn)相應(yīng)神經(jīng)功能損害的綜合征［13］;是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一，具有高發(fā)病率、高致殘率、高復(fù)發(fā)率的特點(diǎn)。正常生理狀態(tài)下，流經(jīng)腦組織的血液為750～1 000 mL/min，為心臟每搏輸出量的1/5，腦組織耗氧量占全身耗氧量的20%～30%，腦細(xì)胞的主要能量來源為有氧代謝產(chǎn)生的葡萄糖，幾乎沒有能量儲(chǔ)備，因此腦組織對(duì)缺血、缺氧性損害十分敏感。如果腦動(dòng)脈血流持續(xù)中斷10～15 min，神經(jīng)元就會(huì)發(fā)生不可逆性損害而壞死［14］。因此，在CIR超急性期采取積極的治療措施恢復(fù)血供尤為重要。溶栓治療可以實(shí)現(xiàn)閉塞腦動(dòng)脈再通，重建腦血流，使受損腦組織的血液重新再灌注，從而挽救缺血半暗帶，迅速恢復(fù)受損傷的神經(jīng)功能，被認(rèn)為是最有效的腦卒中治療方法［15］。而溶栓治療除有出血的并發(fā)癥外，再灌注損傷對(duì)腦細(xì)胞的損害也不可忽視。

表1 各組腦組織細(xì)胞凋亡指數(shù)和CHOP蛋白表達(dá)比較(%，±s)

表1 各組腦組織細(xì)胞凋亡指數(shù)和CHOP蛋白表達(dá)比較(%，±s)

注:與假手術(shù)組同時(shí)點(diǎn)比較，*P＜0.01;與模型組同時(shí)點(diǎn)比較，#P ＜0.05;與同組T0時(shí)點(diǎn)比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;與同組 T1時(shí)比較，☆P ＜0.05，☆☆P ＜0.01

組別 細(xì)胞凋亡指數(shù) CHOP蛋白0.3 ±0.2預(yù)處理組T0 4.1 ±0.3*# 3.7 ±0.8*#T1 5.2 ±1.2*# 4.2 ±1.3*#T2 18.5 ±4.3*#△△☆☆ 12.7 ±1.2*#△☆模型組T0 9.3 ±0.2* 9.8 ±2.1*T1 10.6 ±2.5* 11.3 ±1.2*T2 29.5 ±2.6＊△△☆☆ 27.3 ±1.4＊△△☆假手術(shù)組T0 0 0.2 ±0.1 T1 0 0.2 ±0.1 T20

ERS主要通過以下3種方式誘導(dǎo)細(xì)胞神經(jīng)元凋亡:①CHOP基因激活A(yù)TF4轉(zhuǎn)錄因子持續(xù)表達(dá)促使編碼細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)因子，上調(diào) CHOP表達(dá);CHOP可誘導(dǎo)氧自由基，促使細(xì)胞凋亡。②JNK激活途徑激活JNK誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。③ Caspase-12激活通路激活I(lǐng)RE后，激活Caspase-9、Caspase-3導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本研究采用PA對(duì)CIR大鼠進(jìn)行預(yù)處理后發(fā)現(xiàn)，同時(shí)點(diǎn)腦組織細(xì)胞凋亡指數(shù)、CHOP蛋白表達(dá)比較，模型組 ＞預(yù)處理組 ＞假手術(shù)組，P均 ＜0.05;預(yù)處理組和模型組腦組織細(xì)胞凋亡指數(shù)、CHOP蛋白表達(dá)在缺血再灌注初期表達(dá)量很少，均于再灌注24 h達(dá)到峰值;且預(yù)處理組和模型組的神經(jīng)功能評(píng)分均高于對(duì)照組。不僅說明缺血再灌注過程中CHOP蛋白表達(dá)的上調(diào)啟動(dòng)了ERS，還證明了PA對(duì)于CIR大鼠的神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用，可以拮抗CHOP的表達(dá)，維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，阻斷ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，進(jìn)而減輕神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，PA預(yù)處理可以顯著降低CIR大鼠腦組織細(xì)胞凋亡、CHOP蛋白表達(dá)及神經(jīng)功能評(píng)分，可能與阻斷ERS引發(fā)的細(xì)胞凋亡有關(guān)。但是由于CIR機(jī)制很復(fù)雜，有諸多的環(huán)節(jié)共同作用，而且本研究以大鼠作為研究對(duì)象，和人體有很大的差異，所以PA預(yù)處理是否能在臨床上具有相同的效果仍有待于進(jìn)一步研究。

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