国产日韩欧美一区二区三区三州_亚洲少妇熟女av_久久久久亚洲av国产精品_波多野结衣网站一区二区_亚洲欧美色片在线91_国产亚洲精品精品国产优播av_日本一区二区三区波多野结衣 _久久国产av不卡

?

HPLC-MS/MS法測定全血中他克莫司的濃度

2014-12-03 02:35:10趙冠人彭明麗解放軍309醫(yī)院藥劑科北京0009河北北方學(xué)院河北張家口075000
關(guān)鍵詞:硫酸鋅克莫司全血

趙冠人,申 健,彭明麗,蔣 南(.解放軍309醫(yī)院藥劑科,北京 0009;.河北北方學(xué)院,河北 張家口 075000)

他克莫司(tacrolimus,F(xiàn)K506)是從鏈霉菌的代謝物中分離得到的一種大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑,臨床上廣泛用于預(yù)防和治療器官移植后的排異反應(yīng),其藥效強(qiáng)度是環(huán)孢素的50 ~ 100倍[1]。但他克莫司不良反應(yīng)明顯、治療窗窄、生物利用度低,在藥動學(xué)和藥效學(xué)上存在明顯的個體差異[2],給臨床治療增加了難度,因此在實際應(yīng)用中需進(jìn)行治療藥物監(jiān)測。

目前常用的他克莫司血藥濃度監(jiān)測方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[3]、微粒子酶免疫分析法(MEIA)[4]、高效液相色譜法(HPLC)[5]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)法[6]等。其中,ELISA法和MEIA法對他克莫司的體內(nèi)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生免疫交叉反應(yīng),測定結(jié)果比實際值高;HPLC法的靈敏度無法完全滿足體內(nèi)他克莫司的測定范圍;HPLCMS/MS法靈敏度高,且只測定原型藥物,能更準(zhǔn)確地表達(dá)體內(nèi)他克莫司的含量,可廣泛用于治療藥物監(jiān)測。本研究以地西泮為內(nèi)標(biāo),旨在建立簡便、快速、靈敏的HPLC-MS/MS法測定人全血中他克莫司的濃度。

1 儀器與試藥

API3200型三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀,配有離子噴霧離子化源(ESI)以及Analyst 1.4.1數(shù)據(jù)處理軟件(美國Applied Biosystem公司);Prominence LC-20A超快速高效液相色譜系統(tǒng),包括CBM-20A系統(tǒng)控制器,LC-20AD二元輸液泵,DGU-20A3脫氣裝置,SIL-20AHT自動進(jìn)樣器(日本Shimadzu公司);VDRTEX-5型旋渦混合器(海門其林貝爾儀器制造有限公司);5420型臺式高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司);MG-2200型氮?dú)獯蹈蓛x(東京理化器械株式會社)。

他克莫司(杭州中美華東制藥有限公司,純度:99%,批號20120604);地西泮(中國藥品生物制品檢定所,批號171225);甲醇、乙腈和醋酸銨均為色譜純,硫酸鋅為分析純,水為Milli-Q制備超純水,電阻率為18.2 MΩ·cm(25 ℃);空白全血樣品由解放軍第309醫(yī)院輸血科提供,患者血液樣品由解放軍第309醫(yī)院器官移植中心提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC-MS/MS分析條件

2.1.1 質(zhì)譜條件 離子源:離子噴霧離子化源(ion spray);離子噴射電壓(IS):5500 V;離子源溫度(TEM):450 ℃;源內(nèi)氣體1(GS1,N2):20 psi;源內(nèi)氣體2(GS2,N2):60 psi;氣簾氣體壓力(Cur Gas):30 psi。正離子方式檢測;掃描方式為多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM);DP:67;EP:67;CE:36;CXP:7;用于定量分析的離子反應(yīng)分別為m/z 821.6→768.5(他克莫司)和m/z 285.1→193.1(地西泮)。

2.1.2 色譜條件 色譜柱:Agilent Poroshell 120 SBC18柱(4.6 mm×50 mm,2.7 μm);柱溫40 ℃;流動相A為乙腈溶液,B為含有0.01 mol·L-1醋酸銨與0.5%甲酸的水溶液,采用梯度洗脫,0.01 ~ 0.50 min,A-B(65∶35)→(95∶5),0.51 ~ 2.40 min,A-B(95∶5);2.41 ~ 5.00 min,A-B(65∶35);流速0.7 mL·min-1;柱溫40 ℃;進(jìn)樣量5 μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液與內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱取他克莫司對照品適量,加乙腈溶解,定量配制成14.89、29.78、59.56、119.12、238.24、297.79 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)儲備液。精密稱取地西泮適量,加乙腈溶解,定量配制成32.37 ng·mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液,上述溶液置于6 ℃冰箱儲存。

2.2.2 硫酸鋅溶液的制備 精密稱取硫酸鋅七水合物適量,加純化水溶解,配制成0.02 mol·L-1硫酸鋅溶液。

2.3 全血樣品的處理

取全血樣品100 μL于1.5 mL離心管中,加入內(nèi)標(biāo)溶液10 μL,混勻,加入硫酸鋅溶液100 μL,渦旋混合0.5 min,加入甲醇800 μL,渦旋混合1 min,14 000 r·min-1離心12 min,取上清液于50 ℃下用氮?dú)獯蹈?,殘渣用甲?00 μL溶解,渦旋混合1 min,14 000 r·min-1離心10 min,取上清液5 μL進(jìn)樣分析。

2.4 質(zhì)譜分析

采取正離子方式檢測,將他克莫司溶于流動相中,按“2.1.1”項下操作,于二級全掃描質(zhì)譜圖中獲得他克莫司準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+m/z 821.6,選擇該準(zhǔn)分子離子峰進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)電離,生成主要的碎片離子峰m/z 768.5用于定量。

2.5 方法專屬性考察

分別取空白全血、加入適量他克莫司標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液的全血樣品,按“2.3”項下方法處理,另取他克莫司和內(nèi)標(biāo)的對照品溶液,依“2.1.2”項下方法進(jìn)樣分析,詳見圖1。由圖1可知,他克莫司的保留時間約為2.4 min,內(nèi)標(biāo)地西泮的保留時間約為1.8 min,內(nèi)源性物質(zhì)對測定無干擾,表明本方法具有較高的特異性。

圖1 他克莫司和內(nèi)標(biāo)地西泮的色譜圖A – 空白全血樣品,B – 他克莫司和內(nèi)標(biāo),C – 他克莫司和內(nèi)標(biāo)的全血樣品;1 – 內(nèi)標(biāo)(地西泮),2 – 他克莫司Fig 1 Chromatograms of tacrolimus and diazepamA – blank whole blood, B – tacrolimus and internal standard, C – blank whole blood with tacrolimus and internal standard; 1 – internal standard(diazepam), 2 – tacrolimus

2.6 線性關(guān)系考察

平行吸取6份空白全血90 μL,分別加入10 μL他克莫司標(biāo)準(zhǔn)系列溶液和10 μL內(nèi)標(biāo)溶液,配制成相當(dāng)于全血濃度為1.49、2.98、5.96、11.91、23.82、29.78 ng·mL-1的全血樣品,按“2.3”項下方法處理后,依照“2.1.2”項下條件進(jìn)樣測定,以樣品與內(nèi)標(biāo)峰面積比值(Y)對濃度(C)進(jìn)行回歸計算,得回歸方程:Y = 4.80 C +2.62×10-3(r = 0.999 2),他克莫司在1.49 ~ 29.78 ng·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,最低檢測限為0.50 ng·mL-1。

2.7 基質(zhì)效應(yīng)

精密吸取空白全血100 μL于1.5 mL離心管中,不加內(nèi)標(biāo),按“2.3”項下操作,向獲得的上清液中分別精密加入他克莫司標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液,配制低、中、高三個濃度(分別為2.98、11.91、29.78 ng·mL-1),取5 μL進(jìn)樣分析,測定他克莫司色譜峰面積,求出與對照品溶液測得峰面積的比值為基質(zhì)效應(yīng),結(jié)果表明基質(zhì)效應(yīng)均在85% ~ 115%范圍內(nèi)。

2.8 準(zhǔn)確度與精密度

分別于90 μL的空白全血中加入低、中、高3種濃度的他克莫司對照品溶液10 μL,混勻,得低、中、高3種不同濃度他克莫司的全血樣品,按“2.3”項下方法處理,依法測定批內(nèi)與批間的準(zhǔn)確度與精密度(3 d),詳見表1。

表1 他克莫司的準(zhǔn)確度與精密度. n = 6Tab 1 Precision and accuracy of tacrolimus. n = 6

2.9 提取回收率

配制他克莫司低、中、高濃度(2.98、11.91、29.78 ng·mL-1)全血樣品各3份,按“2.3”項下操作后依法進(jìn)樣,記錄峰面積。另取經(jīng)過預(yù)處理的全血空白基質(zhì),分別加入3個相應(yīng)濃度的對照品溶液進(jìn)行分析。以每一濃度兩種處理方法得到的峰面積比值計算提取回收率。結(jié)果表明,他克莫司各濃度提取回收率均在85% ~ 115%范圍內(nèi)。

2.1 0 穩(wěn)定性考察

分別取他克莫司低、中、高濃度(2.98、11.91、29.78 ng·mL-1)質(zhì)控樣本,按“2.3”項下方法處理后,每一濃度進(jìn)行3個樣本分析,考察全血樣本室溫放置24 h、經(jīng)過3次凍融后他克莫司的穩(wěn)定性,測得濃度與0時刻比較,變化率均小于15%,表明在上述儲存條件下樣品較穩(wěn)定。

2.1 1 臨床應(yīng)用

測定我院24例腎移植患者谷濃度血樣(晨起給藥前靜脈血),按照“2.3”項下方法操作,取上清液5 μL依法進(jìn)樣,記錄FK506峰面積,根據(jù)內(nèi)標(biāo)法計算FK506濃度,濃度范圍為4.21 ~ 12.86 ng·mL-1,濃度均值為(8.14 ± 2.62) ng·mL-1。

3 討論

本研究建立HPLC-MS/MS法測定全血中他克莫司濃度的方法,較以往檢測方法有如下改進(jìn):1)線性范圍方面,王立明等[7]研究發(fā)現(xiàn)全血FK506的理想治療窗濃度范圍應(yīng)為:術(shù)后第1個月內(nèi)為11 ~ 15 ng·mL-1,第2 ~ 3個月為8 ~ 11 ng·mL-1,第3個月以后為5 ~ 8 ng·mL-1,本實驗建立測定方法在1.49 ~ 29.78 ng·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,可完全滿足他克莫司日常治療藥物監(jiān)測需求。2)全血樣本前處理方面,他克莫司在全血中大部分與紅細(xì)胞結(jié)合,少量與脂蛋白結(jié)合,故測定他克莫司血藥濃度需使用全血,且須充分沉淀蛋白以使其轉(zhuǎn)化成游離狀態(tài),再加入破紅細(xì)胞劑硫酸鋅,便于提取完全。文獻(xiàn)[8]報道有乙醚萃取法,操作較為復(fù)雜,也有用3倍量乙腈沉淀蛋白[9-10]的報道,但沉淀比例不夠充分,本實驗采用8倍量甲醇沉淀蛋白,氮?dú)獯抵翚堅笥眉状既芙怆x心,可起到二次沉淀的作用,此方法在保證蛋白沉淀完全的同時起到增加方法靈敏度的效果。3)流動相優(yōu)化方面,文獻(xiàn)[8-9]報道水相一般為不同比例的醋酸銨溶液,本實驗前期研究發(fā)現(xiàn),水相中添加醋酸銨可有效改善他克莫司的峰形,但與其濃度高低的相關(guān)性不大;然而,流動相的酸度高低可對其峰形產(chǎn)生顯著影響。通過在水相中添加0.1%、0.2%、0.5%甲酸用以優(yōu)化他克莫司峰形,結(jié)果表明0.01 mol·L-1醋酸銨與0.5%的甲酸溶液作為水相的條件下分離效果較好,故采用之。4)內(nèi)標(biāo)選擇方面,文獻(xiàn)[6-8]報道多用子囊霉素、環(huán)孢素D為內(nèi)標(biāo),本實驗采用地西泮作為內(nèi)標(biāo),地西泮的質(zhì)譜檢測條件和極性與他克莫司相似,且價格較為低廉,可使他克莫司血藥濃度的日常測定更加經(jīng)濟(jì)、實用。

猜你喜歡
硫酸鋅克莫司全血
獻(xiàn)血間隔期,您了解清楚了嗎?
人人健康(2022年13期)2022-07-25 07:14:30
他克莫司軟膏的處方研究和制備
不足量全血制備去白細(xì)胞懸浮紅細(xì)胞的研究*
福美鈉凈化硫酸鋅溶液的探討
云南化工(2021年6期)2021-12-21 07:31:06
谷子灌漿期噴施硫酸鋅增產(chǎn)
他克莫司聯(lián)合超脈沖CO2點陣激光治療慢性濕疹的療效觀察
豬缺鋅患皮炎咋治
他克莫司軟膏治療面部激素依賴性皮炎的療效
應(yīng)用快速全血凝集試驗法診斷雞白痢和雞傷寒
硫酸鋅電解液中二(2-乙基己基)磷酸酯的測定
苍梧县| 阿拉善右旗| 城固县| 三台县| 霞浦县| 阳朔县| 浑源县| 甘谷县| 汕头市| 同仁县| 五台县| 闸北区| 佳木斯市| 梓潼县| 汝州市| 汪清县| 手游| 特克斯县| 平凉市| 民权县| 鄂托克旗| 西青区| 双峰县| 尚志市| 兴安县| 洮南市| 铜梁县| 肥乡县| 祁东县| 台北市| 蓝山县| 五家渠市| 阿荣旗| 鲁甸县| 花莲市| 台湾省| 明星| 宽城| 宝鸡市| 闸北区| 聂拉木县|