王 巍，王曉華（.解放軍455醫(yī)院藥劑科，上海 0005；.解放軍0醫(yī)院藥劑科，遼寧 沈陽(yáng) 0003）

抑郁癥是由各種原因引起的以抑郁為主要癥狀的一組心境障礙或情感性障礙，是一種以抑郁心境自我體驗(yàn)為中心的臨床癥狀群或狀態(tài)[1]。抑郁癥嚴(yán)重困擾患者的生活和工作，給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)，約15%的抑郁癥患者死于自殺，美國(guó)每年因抑郁癥造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)437億美元[2]。據(jù)國(guó)際衛(wèi)生組織預(yù)測(cè)2020年抑郁障礙將成為全球第二位威脅人類健康、增加經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的疾患[2]。目前抗抑郁藥多以西藥為主，存在藥物副作用多，療效緩慢，且易復(fù)發(fā)，并有較強(qiáng)依賴性等問(wèn)題[3-4]。因此，開(kāi)發(fā)更加安全、高效、依賴性小的抗抑郁藥物已成為當(dāng)前研究的一個(gè)熱點(diǎn)。醒神開(kāi)郁方由石菖蒲、郁金、人參、當(dāng)歸、炒棗仁、山茱萸、 五味子、川芎、丹參、靈芝組成，全方具有醒腦開(kāi)郁、扶正固本之功效。本研究以小鼠懸尾和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)、自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)、利血平誘導(dǎo)小鼠體溫下降實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，探討醒神開(kāi)郁方的抗抑郁作用，為其開(kāi)發(fā)為藥品及臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

ICR小鼠，清潔級(jí)，雄性，體質(zhì)量18 ~ 20 g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002。動(dòng)物飼養(yǎng)于第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室許可證號(hào)：SYXK（滬）2012-0003；在相對(duì)溫度22 ~ 24 ℃、相對(duì)濕度40% ~70%的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)，光照時(shí)間隨自然變化，供給常規(guī)顆粒飼料和過(guò)濾水，自由飲食飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

醒神開(kāi)郁方制備：將組方中的各藥材洗凈、搗碎，浸泡過(guò)夜，按料液比1∶8加水，煮沸后再加熱1 h，重復(fù)上述過(guò)程兩次，過(guò)濾藥渣；合并兩次藥液并蒸干后干燥保存?zhèn)溆?。制得醒神開(kāi)郁方干粉得率為12.84%。所用原藥材均購(gòu)于上海雷允上藥店。

鹽酸氟西汀膠囊（禮來(lái)蘇州制藥有限公司，規(guī)格：20 mg，批號(hào)2072A）；鹽酸氯米帕明片（上海信誼九福藥業(yè)有限公司，規(guī)格：25 mg，批號(hào)120613）；利血平注射液（廣東邦民制藥廠有限公司，規(guī)格：1 mg/mL，批號(hào)090512）。

1.3 試劑及儀器

去甲腎上腺素（NE）（批號(hào)088K1147）、5-羥色胺（5-HT）（批號(hào)0001431934）、多巴胺（DA）（批號(hào)BCBC7614V）均為Sigma公司產(chǎn)品。

JD-2型電子秒表（上海金雀表業(yè)有限公司）；CP225D型電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；T15SL型電子體溫計(jì)（廣州市健奧科技有限公司）；TDL-80-2B型臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；YLS-1A多功能小鼠自主活動(dòng)記錄儀（濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司）；新芝DY89-Ⅱ型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；F-4500熒光分光光度計(jì)（日立公司）。

2 方法

2.1 分組及給藥

ICR小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只。分別為空白對(duì)照組（因受試藥物均用0.5% CMC-Na溶液溶解，因此空白對(duì)照組給予0.5% CMC-Na溶液），醒神開(kāi)郁方低劑量（1.50 g·kg-1）、中劑量（3.00 g·kg-1）、高劑量（6.00 g·kg-1）組和陽(yáng)性藥物組。陽(yáng)性藥物組：小鼠懸尾、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)以及自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)給予鹽酸氟西汀膠囊（10 mg·kg-1）；利血平拮抗實(shí)驗(yàn)給予鹽酸氯米帕明片（30 mg·kg-1）。每天灌胃一次，灌胃量0.02 mL·g-1，連續(xù)給藥7 d。

2.2 小鼠自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)[5]

末次給藥后1 h，將小鼠放入YLS-1A多功能小鼠自主活動(dòng)記錄儀內(nèi)，適應(yīng)3 min后，測(cè)定5 min內(nèi)小鼠的自主活動(dòng)次數(shù)。

2.3 小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)[6]

末次給藥后1 h，用膠帶將小鼠尾在距尾尖2 cm處粘在一水平支撐物上，使動(dòng)物成倒掛狀態(tài)，支撐物放置于一敞口箱內(nèi)，使小鼠頭部離底面約5 cm。小鼠懸掛6 min，記錄后4 min內(nèi)累計(jì)不動(dòng)時(shí)間。

2.4 小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)[7-8]

末次給藥后1 h，將小鼠單獨(dú)置于高20 cm、直徑14 cm的圓柱形玻璃缸中，缸內(nèi)水深10 cm，水溫23 ~25 ℃。放入小鼠使其游泳6 min，記錄后4 min內(nèi)累計(jì)不動(dòng)時(shí)間。

2.5 利血平拮抗實(shí)驗(yàn)[9-10]

該實(shí)驗(yàn)中增加設(shè)置正常對(duì)照組小鼠10只；空白對(duì)照組給予0.5% CMC-Na溶液。各組動(dòng)物末次給藥前1 h用電子溫度計(jì)插入小鼠肛門內(nèi)約1.5 ~ 2 cm處測(cè)定肛溫，作為正常體溫值。除正常對(duì)照組外，其他各組測(cè)體溫后腹腔注射利血平注射液4 mg·kg-1（0.2 mg·mL-1，0.02 mL·g-1體質(zhì)量）。觀察指標(biāo)：1）灌胃給藥4 h后，再次測(cè)定各組動(dòng)物的肛溫，記錄前后體溫變化的差異。2）觀察1 h后15 s內(nèi)小鼠眼瞼下垂的情況。按Rubin分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，判斷下垂度。0度：正常開(kāi)目；1度：眼瞼下垂1/4；2度：眼瞼下垂1/2；3度：眼瞼下垂3/4；4度：眼瞼完全閉合。3）小鼠腦內(nèi)單胺遞質(zhì)含量測(cè)定。給藥后禁食不禁水，24 h后處死小鼠，迅速斷頭取出大腦，冰浴中勻漿，3000 r·min-1離心10 min，取上清液，熒光法測(cè)定單胺類神經(jīng)遞質(zhì)NE、5-HT以及DA的含量。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 對(duì)小鼠自主活動(dòng)和不動(dòng)時(shí)間的影響

由表1結(jié)果可知，醒神開(kāi)郁方低、中、高劑量組小鼠自主活動(dòng)數(shù)與空白對(duì)照組比較均無(wú)顯著性變化（P >0.05），表明醒神開(kāi)郁方對(duì)小鼠自主活動(dòng)無(wú)顯著影響。與空白對(duì)照組比較，陽(yáng)性藥鹽酸氟西汀組能夠顯著縮短小鼠懸尾和強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間（P < 0.01）。醒神開(kāi)郁方低劑量組較空白對(duì)照組能縮短小鼠懸尾和強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間（P < 0.05）；醒神開(kāi)郁方中、高劑量組較空白對(duì)照組均能縮短小鼠懸尾和強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間，具有顯著性差異（P < 0.01）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明醒神開(kāi)郁方具有抗抑郁作用。

表1 醒神開(kāi)郁方對(duì)小鼠自主活動(dòng)和不動(dòng)時(shí)間的影響. n = 10，±sTab 1 Effect of Xingshen Kaiyu prescriptions on the spontaneous motor activity and the immobility duration in mice. n = 10，±s

表1 醒神開(kāi)郁方對(duì)小鼠自主活動(dòng)和不動(dòng)時(shí)間的影響. n = 10，±sTab 1 Effect of Xingshen Kaiyu prescriptions on the spontaneous motor activity and the immobility duration in mice. n = 10，±s

注：與空白對(duì)照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01Note: compared with the blank control group, *P < 0.05, **P < 0.01

組別 劑量/g·kg-1自主活動(dòng)計(jì)數(shù)/次懸尾不動(dòng)時(shí)間/s強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間/s空白對(duì)照組 – 202.1±19.8 113.6±29.6 98.3±22.8鹽酸氟西汀組 0.01 204.2±23.4 64.6±22.2** 41.1±12.9**醒神開(kāi)郁方低劑量組1.50 189.3±17.1 82.9±20.3* 70.4±22.4*醒神開(kāi)郁方中劑量組3.00 201.8±19.0 75.6±17.7** 67.5±12.8**醒神開(kāi)郁方高劑量組6.00 192.5±18.9 68.7±18.8** 58.1±23.3**

3.2 對(duì)利血平所致小鼠體溫下降和眼瞼下垂的影響

小鼠注射利血平后，出現(xiàn)了明顯的上瞼下垂、體溫下降等癥狀，空白對(duì)照組與正常對(duì)照組比較差異非常顯著（P < 0.01）。醒神開(kāi)郁方中、高劑量組較空白對(duì)照組顯著抑制利血平所致小鼠體溫的下降（P <0.05，P < 0.01）；與空白對(duì)照組比較，醒神開(kāi)郁方低、中、高劑量組顯著拮抗利血平所致小鼠眼瞼下垂作用（P < 0.05，P < 0.05，P < 0.01）。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 醒神開(kāi)郁方對(duì)利血平所致小鼠體溫下降和眼瞼下垂的影響.n = 10，±sTab 2 Effect of Xingshen Kaiyu prescriptions on the ptosis and hypothermia induced by reserpine in mice. n = 10，±s

表2 醒神開(kāi)郁方對(duì)利血平所致小鼠體溫下降和眼瞼下垂的影響.n = 10，±sTab 2 Effect of Xingshen Kaiyu prescriptions on the ptosis and hypothermia induced by reserpine in mice. n = 10，±s

注：與空白對(duì)照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01；與正常對(duì)照組比較，ΔP < 0.05，ΔΔP < 0.01Note: compared with the blank control group, *P < 0.05, **P < 0.01;compared with normal control group, ΔP < 0.05, ΔΔP <0.01

組別 劑量/g·kg-1 肛溫下降變化/℃眼瞼下垂程度/度正常對(duì)照組 – 0.5±0.3 0空白對(duì)照組 – 3.0±0.7ΔΔ 3.3±0.9Δ Δ鹽酸氯米帕明組 0.03 1.0±0.4** 1.3±0.9**醒神開(kāi)郁方低劑量組 1.50 2.4±0.7 2.1±1.2*醒神開(kāi)郁方中劑量組 3.00 2.1±0.6* 1.9±1.1*醒神開(kāi)郁方高劑量組 6.00 1.5±0.6** 1.6±1.0**

3.3 對(duì)腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組小鼠腦組織內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)NE、5-HT、DA含量減少，與正常對(duì)照組比較均有顯著性差異（P < 0.01）。與空白對(duì)照組比較，醒神開(kāi)郁方低劑量組能夠顯著升高小鼠腦組織內(nèi)NE和5-HT含量（P < 0.01），對(duì)小鼠腦組織內(nèi)DA含量也有升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與空白對(duì)照組比較，醒神開(kāi)郁方中、高劑量組均顯著升高小鼠腦組織內(nèi)NE和5-HT含量（P < 0.01）；醒神開(kāi)郁方中、高劑量組小鼠腦組織內(nèi)DA含量較空白對(duì)照組的升高具有顯著性差異（P < 0.05，P < 0.01）。詳見(jiàn)表3。

表3 醒神開(kāi)郁方對(duì)小鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響. n = 10，±sTab 3 Effect of Xingshen Kaiyu prescriptions on the levels of monoamine neurotransmitter in brain of mice. n = 10，±s

表3 醒神開(kāi)郁方對(duì)小鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響. n = 10，±sTab 3 Effect of Xingshen Kaiyu prescriptions on the levels of monoamine neurotransmitter in brain of mice. n = 10，±s

注：與空白對(duì)照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01；與正常對(duì)照組比較，ΔP < 0.05，ΔΔP < 0.01Note: compared with the blank control group, *P < 0.05, **P < 0.01;compared with normal control group, ΔP < 0.05, ΔΔP < 0.01

組別 劑量/g·kg-1 NE/ng·g-1 5-HT/ng·g-1 DA/ng·g-1正常對(duì)照組 – 613.2±72.0 494.8±38.9 821.8±112.2空白對(duì)照組 – 303.8±48.8ΔΔ 262.9±38.2ΔΔ 399.2±61.1ΔΔ鹽酸氯米帕明組0.03 493.3±62.0** 364.8±47.6** 589.2±108.9**醒神開(kāi)郁方低劑量組1.50 406.1±66.8** 330.9±47.0** 488.8±66.9醒神開(kāi)郁方中劑量組3.00 458.4±92.1** 353.4±54.8** 514.5±72.4*醒神開(kāi)郁方高劑量組6.00 507.8±72.8** 380.7±40.8** 566.2±87.4**

4 討論

強(qiáng)迫游泳和懸尾實(shí)驗(yàn)屬于行為絕望模型，是經(jīng)典的抗抑郁藥物篩選模型，被廣泛用于抗抑郁藥物的研究。但這兩種模型也存在一定的局限性，一些增加動(dòng)物活動(dòng)的興奮性藥物也可能出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)可以有效的反映動(dòng)物自發(fā)行為、活動(dòng)及情緒狀態(tài)，其活動(dòng)強(qiáng)度在一定程度上也可反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮或抑制狀態(tài)[11]。本研究中小鼠自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組小鼠自主活動(dòng)次數(shù)均值202.1次，醒神開(kāi)郁方低、中、高劑量組小鼠自主活動(dòng)次數(shù)均值分別為189.3次、201.8次和192.5次；各組間比較無(wú)顯著性變化，表明醒神開(kāi)郁方對(duì)小鼠自主活動(dòng)無(wú)顯著性影響。

小鼠在懸尾及強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的不動(dòng)狀態(tài)反映了動(dòng)物的絕望行為，可模擬人類的抑郁狀態(tài)。懸尾和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，醒神開(kāi)郁方能顯著縮短小鼠懸尾和強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間，表明其具有較強(qiáng)的抗抑郁作用，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)無(wú)興奮或抑制作用，其抗抑郁作用并非中樞興奮或抑制作用所致，可能是通過(guò)參與調(diào)節(jié)中樞不同單胺能神經(jīng)傳導(dǎo)功能所產(chǎn)生抗抑郁作用[12]。

抑郁癥發(fā)病機(jī)制至今未明確闡明，但大量實(shí)驗(yàn)研究表明單胺類神經(jīng)遞質(zhì)尤其是5-HT、NE以及DA含量改變與抑郁癥有密切關(guān)系[13]；也有報(bào)道指出腦內(nèi)單胺類遞質(zhì)缺乏或相對(duì)不足是導(dǎo)致抑郁癥的最直接因素[14-15]。利血平誘導(dǎo)體溫下降實(shí)驗(yàn)是研究抗抑郁藥物作用機(jī)理經(jīng)典實(shí)驗(yàn)之一，該方法簡(jiǎn)單可靠。利血平是一種囊泡再攝取抑制劑，它使遞質(zhì)留在囊泡外，易被單胺氧化酶降解，從而使NE、DA和5-HT等耗竭，引起體溫下降、上眼瞼下垂、少動(dòng)等癥狀。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，醒神開(kāi)郁方能顯著提高小鼠腦組織內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)NE、5-HT、DA含量，提示其抗抑郁作用的機(jī)制與增加腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量，調(diào)節(jié)NE、5-HT和DA能神經(jīng)的活性有關(guān)。醒神開(kāi)郁方可通過(guò)改變中樞單胺遞質(zhì)的含量，繼而影響其他系統(tǒng)功能活動(dòng)從而發(fā)揮抗抑郁作用。

綜上，醒神開(kāi)郁方抗抑郁作用療效顯著，由于中藥方劑具有多成分、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)的作用特性，故對(duì)醒神開(kāi)郁方中具有抗抑郁作用的活性部位、活性成分及其他抗抑郁作用機(jī)理的闡明尚需進(jìn)一步的研究。