張 琴，劉澤源，曲恒燕（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院臨床藥理學(xué)研究室，北京 100071）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是一種進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。目前，治療藥物僅能改善AD患者的部分癥狀，而不能減輕神經(jīng)細(xì)胞的退化和AD疾病的發(fā)展進(jìn)程，故需尋求能夠營養(yǎng)或修復(fù)神經(jīng)元、改善AD病理進(jìn)展的藥物。AD主要的病理特征為β淀粉樣肽（β-amyloid fragment，Aβ）沉積所形成的老年斑和tau蛋白過度異常磷酸化導(dǎo)致的神經(jīng)纖維纏結(jié)[1]。Aβ的沉積和聚集是導(dǎo)致AD發(fā)生的重要因素[2-3]，而聚集態(tài)的 Aβ25-35是β淀粉樣肽對(duì)神經(jīng)元的直接毒性片段[4]。重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子（recombinant human ciliary neurotrophic factor，rhCNTF）能夠維持多種神經(jīng)細(xì)胞的存活，阻止體內(nèi)神經(jīng)元的退行性喪失[5-6]。本實(shí)驗(yàn)采用聚集態(tài)Aβ25-35損傷體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元以模擬體內(nèi)神經(jīng)元受損狀態(tài)，考察rhCNTF對(duì)損傷細(xì)胞的作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新生24 h的Wistar乳鼠，SPF級(jí)，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK-（軍）2012-0004。

1.2 藥物與試劑

rhCNTF（美國Sigma公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；馬血清（Gibco公司）；DMEM培養(yǎng)基（HyClone公司）；N-2（Gibco公司）；B-27（Gibco公司）；阿糖胞苷（美國Sigma公司）；Aβ25-35（美國Sigma公司）；多聚賴氨酸（美國Sigma公司）；NSE免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；CCK-8溶液（日本株式會(huì)社同仁化學(xué)研究所）；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）。

1.3 儀器

倒置熒光顯微鏡IX-51（Olympus公司）；全自動(dòng)酶標(biāo)儀-128C（CliniBio公司）；流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson公司）。

1.4 海馬神經(jīng)元的分離與培養(yǎng)

取新生24 h的Wistar乳鼠，酒精消毒斷頭后，分離海馬組織，將其放入盛有預(yù)先冰冷的解剖液的平皿中，用0.25%胰蛋白酶于37 ℃消化20 min，800 r·min-1離心5 min后用種植液重懸、過濾，制成細(xì)胞懸液，活細(xì)胞以106個(gè)· mL-1的密度接種在涂有多聚賴氨酸的6孔板中，置37 ℃、5% CO2孵育箱培養(yǎng)。24 h后鏡下可見細(xì)胞貼壁生長，進(jìn)行全量換成含N-2和B-27的飼養(yǎng)液，以后隔天半量換液。培養(yǎng)72 h后加阿糖胞苷以抑制非神經(jīng)元細(xì)胞生長。

1.5 海馬神經(jīng)元的鑒定

將培養(yǎng)至第7天的海馬神經(jīng)元進(jìn)行SABC法免疫組化鑒定，實(shí)驗(yàn)操作按照武漢博士德生物工程有限公司NSE免疫組化試劑盒的說明進(jìn)行。

1.6 CCK-8法檢測海馬神經(jīng)元的活動(dòng)度

1.6.1 Aβ25-35損傷后再給予rhCNTF 將Aβ25-35于37 ℃溫育72 h，使其成為有直接毒性的凝聚態(tài)，并使Aβ25-35的終濃度為10 μmol·L-1；使rhCNTF溶液的終濃度為100 ng·mL-1。培養(yǎng)至第7天的海馬神經(jīng)元以5×105個(gè)·mL-1的密度種植到96孔板用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組為：空白組；對(duì)照組（DMEM培養(yǎng)基）；Aβ25-35組（10 μmol·L-1）；rhCNTF組（100 ng·mL-1）；Aβ25-35+ rhCNTF組（10 μmol·L-1的Aβ25-35+ 100 ng·mL-1的rhCNTF）。待細(xì)胞貼壁后，加入Aβ25-35溶液孵育24 h，加入rhCNTF溶液孵育24 h。加入CCK-8溶液孵育2 h，于450 nm波長處用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測定吸光度值（A450）。計(jì)算細(xì)胞活動(dòng)度，細(xì)胞活動(dòng)度=A450（試驗(yàn)組-空白組）/A450（對(duì)照組-空白組）×100%。

1.6.2 rhCNTF預(yù)防后再給予Aβ25-35實(shí)驗(yàn)分組為：空白組；對(duì)照組（DMEM培養(yǎng)基）；Aβ25-35組（10 μmol·L-1）；rhCNTF 組（100 ng·mL-1）；rhCNTF + Aβ25-35組（100 ng·mL-1的rhCNTF + 10 μmol·L-1的Aβ25-35）。待細(xì)胞貼壁后，加入rhCNTF孵育24 h，加入Aβ25-35溶液孵育24 h。加入CCK-8溶液孵育2 h，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測定吸光度值（A450），計(jì)算細(xì)胞活動(dòng)度。

1.7 海馬神經(jīng)元早期凋亡的測定

采用Annexin V-FITC/PI法凱基生物試劑盒進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 海馬神經(jīng)元的鑒定

培養(yǎng)7 d的海馬神經(jīng)元經(jīng)NSE免疫組化鑒定，陽性細(xì)胞的胞漿被染成棕黃色。圖1為成熟生長的海馬神經(jīng)元，突起生長繁多，神經(jīng)細(xì)胞交錯(cuò)成網(wǎng)格。

圖1 海馬神經(jīng)元的鑒定（× 200）Fig 1 Identification of hippocampal neurons (× 200)

2.2 rhCNTF促進(jìn)海馬神經(jīng)元生長

rhCNTF作用的海馬神經(jīng)元的細(xì)胞活動(dòng)度與rhCNTF的濃度呈指數(shù)相關(guān)。詳見圖2。

圖2 rhCNTF對(duì)海馬神經(jīng)元的促生長作用. x ± s, n = 3Fig 2 The growth-promoting effect of rhCNTF on hippocampal neurons.x ± s, n = 3

2.3 rhCNTF對(duì)Aβ25-35損傷的海馬神經(jīng)元有改善作用

Aβ25-35組可見淀粉樣沉淀且細(xì)胞活動(dòng)度降低，而rhCNTF可改善Aβ25-35的損傷作用，不僅使神經(jīng)元形態(tài)正常而且使細(xì)胞活動(dòng)度明顯增加（P ＜ 0.01）。詳見圖3、圖4。

圖3 海馬神經(jīng)元的形態(tài)觀察（×100）A – 對(duì)照組，B – Aβ25-35（10 μmol·L-1）組，C – Aβ25-35（10 μmol·L-1）+rhCNTF（100 ng·mL-1）組，D – rhCNTF （100 ng·mL-1）組Fig 3 Microscopic observation of morphology of hippocampal neurons (×100)A – control group, B – Aβ25-35 (10 μmol·L-1) group, C – Aβ25-35 (10 μmol· L-1)+ rhCNTF (100 ng·mL-1) group, D – rhCNTF (100 ng·mL-1) group

圖4 海馬神經(jīng)元細(xì)胞活動(dòng)度的變化. n = 6A – 對(duì)照組，B – Aβ25-35（10 μmol·L-1）組，C – Aβ25-35 (10 μmol·L-1) +rhCNTF (100 ng·mL-1)組，D – rhCNTF (100 ng·mL-1)組注：與A組比較，*P = 0.000 4；與B組比較，#P = 0.002 2Fig 4 Variation of cell viability of hippocampal neurons. n = 6 A – control group, B – Aβ25-35 (10 μmol·L-1) group, C – Aβ25-35 (10 μmol·L-1) + rhCNTF (100 ng·mL-1) group, D – rhCNTF (100 ng·mL-1) groupNote: compared with group A, *P = 0.000 4; compared with group B,#P = 0.002 2

2.4 rhCNTF預(yù)防海馬神經(jīng)元免受損傷

rhCNTF預(yù)處理海馬神經(jīng)元后，Aβ25-35對(duì)細(xì)胞的生長密度和樹突結(jié)構(gòu)無明顯影響；rhCNTF + Aβ25-35組的細(xì)胞活動(dòng)度較Aβ25-35組顯著增加（P ＜ 0.000 1）。見圖5、6。

圖5 經(jīng) rhCNTF預(yù)防下的海馬神經(jīng)元的形態(tài)（×40）A – 對(duì)照組，B – rhCNTF（100 ng·mL-1） + Aβ25-35（10 μmol·L-1）組，C –rhCNTF （100 ng·mL-1）組Fig 5 Morphology of hippocampal neurons treated with rhCNTF prevention (×40)A – control group, B – rhCNTF (100 ng·mL-1) + Aβ25-35 (10 μmol·L-1)group, C – rhCNTF (100 ng·mL-1) group

圖6 rhCNTF預(yù)防下的海馬神經(jīng)元的細(xì)胞活動(dòng)度. n = 3A – 對(duì)照組，B – Aβ25-35（10 μmol·L-1）組，C – rhCNTF (100 ng·mL-1) +Aβ25-35 (10 μmol·L-1)組，D – rhCNTF (100 ng·mL-1)組注：與A組比較，*P = 0.046 4；與B組比較，#P ＜ 0.000 1Fig 6 Cell viability of hippocampal neurons treated with rhCNTF prior to Aβ25-35 by CCK-8. n = 3A – control group, B – Aβ25-35 (10 μmol·L-1) group, C – rhCNTF (100 ng·mL-1) + Aβ25-35 (10 μmol·L-1) group, D – rhCNTF (100 ng·mL-1) groupNote: compared with group A, *P = 0.046 4; compared with group B,#P ＜ 0.000 1

2.5 rhCNTF降低海馬神經(jīng)元的早期凋亡

Q1象限表示為壞死細(xì)胞，Q2象限為晚期凋亡細(xì)胞和機(jī)械損傷細(xì)胞，Q3象限為早期凋亡細(xì)胞，Q4象限為正常活細(xì)胞。相對(duì)于對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率（3.77%），Aβ25-35組的細(xì)胞凋亡率（7.33%）較高，而Aβ25-35+ rhCNTF組的細(xì)胞凋亡率（6.75%）有所降低。詳見圖7。

3 討論

海馬神經(jīng)元是哺乳動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知功能的重要神經(jīng)細(xì)胞。海馬神經(jīng)元的萎縮或損傷會(huì)導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶、認(rèn)知功能以及生活能力的減退，也是導(dǎo)致AD的關(guān)鍵神經(jīng)元[7]。本實(shí)驗(yàn)體外培養(yǎng)乳鼠海馬神經(jīng)元，并采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)NSE染色，成功鑒定海馬神經(jīng)元，模擬體內(nèi)海馬神經(jīng)元的生存狀況以及受損狀態(tài)。

在AD的發(fā)病機(jī)理中，主要病理變化為大腦皮層萎縮、Aβ沉積、神經(jīng)原纖維纏結(jié)、大量記憶性神經(jīng)元數(shù)目減少，以及老年斑的形成[8]；而Aβ25-35是β淀粉樣蛋白的主要毒性片段，其大量聚集和沉積導(dǎo)致老年斑的形成，這是AD形成的關(guān)鍵所在[9]。因此本實(shí)驗(yàn)采用Aβ25-35損傷海馬神經(jīng)元來考察rhCNTF對(duì)損傷細(xì)胞的作用。

AD患者的CNTF蛋白和mRNA水平有所降低[10]。在模擬海馬神經(jīng)元損傷的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)rhCNTF能夠?qū)笰 β引起的海馬神經(jīng)元損傷。rhCNTF對(duì)海馬神經(jīng)元有維持和促進(jìn)生長的作用，這種作用與海馬神經(jīng)元的活動(dòng)度呈指數(shù)相關(guān)；本實(shí)驗(yàn)中rhCNTF溶液的濃度已能使海馬神經(jīng)元的存活率達(dá)到最大。rhCNTF不僅能夠改善已遭受Aβ?lián)p傷的海馬神經(jīng)元的生長狀態(tài)和細(xì)胞活力，還能夠預(yù)防對(duì)抗Aβ的損傷作用。另外，Aβ引起海馬神經(jīng)元的早期凋亡而rhCNTF可緩解這種凋亡效應(yīng)。說明rhCNTF對(duì)抗Aβ?lián)p傷細(xì)胞的機(jī)制，是通過支持和營養(yǎng)神經(jīng)元，提高細(xì)胞活力，以及減少細(xì)胞早期凋亡等途經(jīng)發(fā)揮作用。這對(duì)前期關(guān)于rhCNTF通過降低過氧化水平而達(dá)到改善和緩解Aβ?lián)p傷作用的研究進(jìn)行了補(bǔ)充[11]。本研究為CNTF用于預(yù)防和治療AD疾病提供了理論依據(jù)。