孔根現(xiàn) 李 麗 蔣知新 張清華 (南方醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，廣東 廣州 5055)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)起源于中胚層，可誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，脂肪細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞，肝細(xì)胞等多種細(xì)胞〔1〕，且具有低免疫原性，對多種免疫細(xì)胞具有調(diào)控功能〔2〕，是目前研究最熱的成體干細(xì)胞。在胚胎發(fā)育過程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞(VECs)是由中胚層干細(xì)胞分化而來，在血管重建修復(fù)損傷組織過程中具有重要作用，因而誘導(dǎo)BMSCs定向分化為VECs在構(gòu)建血管組織工程方面具有重要意義。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)對體外誘導(dǎo)MSCs分化為VECs具有重要作用，如果培養(yǎng)基中失去了 VEGF，那么 VECs的特征就難以維持〔3，4〕，而堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)具有促進(jìn)血管生成、損傷修復(fù)、神經(jīng)修復(fù)等作用〔5，6〕，且對中胚層和神經(jīng)外胚層來源干細(xì)胞的增殖和分化具有重要作用，是誘導(dǎo)MSCs分化為VECs必不可少的因子之一〔1，7，8〕。本實驗聯(lián)合應(yīng)用 VEGF 和 bFGF，體外誘導(dǎo)BMSCs定向分化為VECs，并探索提高誘導(dǎo)率的方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 L-DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清(GIBCO)，胰蛋白酶(Sigma)，磷酸鹽緩沖液(HyClone)，雙抗(HyClone)，CD45 抗體(PE)及其二抗(SANTA CRUZ)，CD29、CD34、CD90單抗(FITC)和同型對照抗體(Abcam)，VEGF和bFGF(上海博邁生物科技)，CD31抗體及FITC標(biāo)記的同型對照抗體(Bioss)，NO檢測試劑盒(北京普利萊)，細(xì)胞培養(yǎng)皿、細(xì)胞培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板(Corning)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(SANYO)，流式細(xì)胞儀(Beckman)，倒置顯微鏡(日本Olympus)。

1.2 實驗動物 健康純種新西蘭大白兔，雌雄不限，4～5周齡，體重1 kg左右，用于提取MSCs，由解放軍海軍總醫(yī)院實驗動物中心提供。

1.3 方法

1.3.1 兔BMSCs的分離培養(yǎng) 穿刺抽取股骨及脛骨骨髓，用密度梯度離心法〔9〕獲取 BMSCs，接種于培養(yǎng)皿中，放入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后首次換液，棄去未貼壁及死亡細(xì)胞，此后每3 d換1次液，細(xì)胞融合達(dá)80%～90%時，以1∶3的比例傳代。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照記錄。

1.3.2 流式檢測BMSCs表面抗原 P3代細(xì)胞融合達(dá)80%左右時，消化計數(shù)，重懸細(xì)胞濃度為1×107/ml，每個流式管取100 μl細(xì)胞懸液，分別加入 2 μl濃度為 2 g/L 的 CD29、CD34、CD45、CD90抗體及同型對照抗體，4℃避光孵育30 min，加入細(xì)胞洗液漂洗2次，去上清，控干后每管加入0.5 ml固定液，混勻。檢測時，先做同型對照，調(diào)整電壓至陰性區(qū)范圍，再測實驗管。

1.3.3 成骨和成脂誘導(dǎo)以及染色 取第3代對數(shù)生長期的細(xì)胞，消化計數(shù)，重懸細(xì)胞濃度為1×104/ml，接種于六孔板中常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁融合達(dá)到約80%時，對照組不變，實驗組移去原培養(yǎng)液，每孔加入2 ml誘導(dǎo)培養(yǎng)液，每3天換一次液，成骨誘導(dǎo)21 d茜素紅染色鑒定，成脂誘導(dǎo)15 d油紅O染色，倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.3.4 BMSCs向VECs誘導(dǎo)分化 擴增至第3代的細(xì)胞消化后以1×104/ml接種于6孔板中，次日換液，實驗組(A、B兩組)加入誘導(dǎo)培養(yǎng)液(10%FBS的L-DMEM培養(yǎng)基中含20 μg/L的 VEGF、10 μg/L 的 bFGF)2 ml，第 15 天，A 組以 1∶2傳代，B組不變，兩組均誘導(dǎo)24 d;對照組(C組)常規(guī)培養(yǎng)。鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化并拍照記錄。

1.3.5 CD31抗原流式檢測 誘導(dǎo)第24天，流式分析細(xì)胞表面CD31抗原的表達(dá)(方法同1.3.2)。

1.3.6 NO分泌量的檢測 細(xì)胞誘導(dǎo)24 d后，取上清液，儲存于-80℃冰箱內(nèi)。檢測時，96孔板中每孔加入50 μl標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，而后加入50 μl Griess R1，室溫避光放置5 min，再加入50 μl Griess R2，室溫避光放置5 min后應(yīng)用 XD711酶標(biāo)儀540 nm測定吸光度;以平均吸光度OD值為x軸，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為y軸，用Excel作圖得到標(biāo)準(zhǔn)曲線公式，將樣品OD值代入公式計算NO濃度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計處理，方差齊性時采用單向方差分析，組間的多重比較采用LSD法，方差不齊時采用Welch近似方差分析，組間的多重比較采用Dunnett T3法。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs形態(tài)特點 原代細(xì)胞多為圓形和梭形，成集落樣生長，8～10 d細(xì)胞融合可達(dá)80% ～90%，經(jīng)換液及貼壁篩選，細(xì)胞純度不斷提高，擴增至第3代時，細(xì)胞狀態(tài)最佳，鏡下見細(xì)胞形態(tài)均一，魚群狀排列，呈典型的梭形(圖1)。

2.2 BMSCs表面抗原的表達(dá) BMSCs高表達(dá)CD29和CD90，陽性率分別為98.21%和86.20%，低表達(dá)CD34和CD45，陽性率僅為0.36%和2.03%。

2.3 成骨和成脂誘導(dǎo)染色 成骨誘導(dǎo)21 d茜素紅染色，實驗組可見散在的深紅色鈣結(jié)節(jié)，C組無明顯改變;成脂誘導(dǎo)15 d油紅O染色，實驗組可見含有紅色脂滴的脂肪細(xì)胞，C組未見脂肪細(xì)胞(圖2)。

2.4 BMSCs向內(nèi)皮誘導(dǎo)后形態(tài)變化 加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基后，細(xì)胞增殖的同時形態(tài)逐漸由長梭形轉(zhuǎn)變?yōu)槎趟笮?，最后形成以圓形和橢圓形為主外觀為“鋪路石”狀的細(xì)胞群(圖3)。

2.5 CD31分子流式檢測 誘導(dǎo)24 d后，CD31陽性率A組為57.3%，B 組為43.8%，C 組為0.8%。

2.6 NO分泌量的檢測 誘導(dǎo)后A、B、C三組NO的分泌量分別為 (103.91 ± 11.91)μmol/L，(91.59 ± 6.91)μmol/L 和(3.95±1.43)μmol/L。方差齊性檢驗顯示方差不齊(F=10.083，P＜0.05);Welch近似方差分析顯示三組細(xì)胞NO分泌量的總體均數(shù)不全相等(P＜0.05)，進(jìn)一步的組間多重比較顯示三組細(xì)胞兩兩之間的差異均具有顯著性(P＜0.05)。

圖1 BMSCs的形態(tài)特點

圖2 成骨和成脂誘導(dǎo)染色

圖3 內(nèi)皮化誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)

3 討論

內(nèi)皮細(xì)胞是心腦血管疾病發(fā)病的關(guān)鍵所在，VECs損傷是心腦血管疾病的主要危險因素之一，因而對VECs損傷的修復(fù)具有積極的意義。Herring等〔10〕提出過運用自體VECs構(gòu)建人工血管的技術(shù)方法，但取材數(shù)量有限且體外擴增后細(xì)胞活性和功能下降，因而得不到推廣;胚胎干細(xì)胞能夠穩(wěn)定擴增且具備多向分化潛能，但其獲取和建系必須破壞胚囊，從而引起了諸多關(guān)于倫理道德的爭論。BMSCs具有多向分化潛能，來源廣泛，不存在倫理道德問題，是VECs來源的理想種子細(xì)胞。

目前已建立了多種誘導(dǎo)BMSCs分化為VECs的體系，主要包括損傷組織微環(huán)境誘導(dǎo)體系，內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)體系，細(xì)胞因子聯(lián)合誘導(dǎo)體系等。損傷組織微環(huán)境誘導(dǎo)體系是利用損傷組織缺血缺氧等特殊的微環(huán)境作用誘導(dǎo)BMSCs分化為VECs，多用于 MSCs的體內(nèi)實驗研究〔11，12〕;內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)體系是通過將BMSCs與內(nèi)皮細(xì)胞共同培養(yǎng)來誘導(dǎo)BMSCs的分化，一般在三維培養(yǎng)系統(tǒng)中進(jìn)行〔13〕;細(xì)胞因子聯(lián)合誘導(dǎo)體系是指在培養(yǎng)基中添加兩種或兩種以上的細(xì)胞因子來誘導(dǎo)BMSCs向VECs分化，其中VEGF是必不可少的誘導(dǎo)因子，bFGF是最為常見的輔助因子。前兩種體系在操作和分析方面相對復(fù)雜，并且許多研究表明損傷微環(huán)境和共培養(yǎng)體系中發(fā)揮誘導(dǎo)作用的物質(zhì)主要是細(xì)胞因子，所以細(xì)胞因子聯(lián)合誘導(dǎo)體系越來越受到研究者的重視。

但是，細(xì)胞因子聯(lián)合誘導(dǎo)體系存在誘導(dǎo)效率相對較低的問題。許多學(xué)者針對此問題進(jìn)行了相關(guān)探索，并提出了一些解決方案，包括基因轉(zhuǎn)染，添加活性物質(zhì)等〔8，14〕，而傳代對誘導(dǎo)效率影響的報道卻比較少見。實驗中，本研究將BMSCs誘導(dǎo)分化為了VECs，并且發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)過程中進(jìn)行傳代能夠提高CD31的表達(dá)和NO的分泌量，經(jīng)過統(tǒng)計分析差異具有顯著性。從而證實了聯(lián)用VEGF和bFGF誘導(dǎo)BMSCs分化為VECs的可行性，也提示了傳代能夠提高該過程的誘導(dǎo)效率，為提高誘導(dǎo)效率提供了一條簡單有效的途徑。

1 Lee SK，Kim Y，Kim SS，et al.Differential expression of cell surface proteins in human bone marrow mesenchymal stem cells cultured with or without basic fibroblast growth factor containing medium〔J〕.Proteomics，2009;9(18):4389-405.

2 Aggarwal S，Pittenger MF.Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses〔J〕.Blood，2005;105(4):1815-22.

3 Fischer LJ，McIlhenny S，Tulenko T，et al.Endothelial differentiation of adipose-derived stem cells:effects of endothelial cell growth supplement and shear force〔J〕.J Surg Res，2009;152(1):157-66.

4 Al-Khaldi A，Eliopoulos N，Martineau D，et al.Postnatal bone marrow stromal cells elicit a potent VEGF-dependent neoangiogenic response in vivo〔J〕.Gene Ther，2003;10(8):621-9.

5 Chan JP，Sherrie GC，Carol A，et al.Accelerated wound closure of pressure ulcers in aged mice by chitosan scaffolds with and without bFGF〔J〕.Acta Biomaterialia，2009;5(6):1926-36.

6 Hsuan SL，Klintworth HM，Xia Z.Basic fibroblast growth factor protects against rotenone-induced dopaminergic cell death through activation of extracellular signal-regulated kinases 1/2 and phosphatidylinositol-3 kinase pathways〔J〕.Neurosci，2006;26(17):4481-91.

7 Annabi B，Naud E，Lee YT，et al.Vascular progenitors derived from murine bone marrow stromal cells are regulated by fibroblast growth factor and are avidly recruited by vascularizing tumors〔J〕.Cell Biochem，2004;91(6):1146-58.

8 Wan SY，Zhang TF，Ding Y.Galectin-3 enhances proliferation and angiogenesis of endothelial cells differentiated from bone marrow mesenchymal stem cells〔J〕.Transplant Proc，2011;43(10):3933-8.

9 Paniushina OV，Bueverova I，Satdykova GP，et al.Comparative investigation of mesenchymal stem cells isolated from the bone marrow and embryonic liver of mouse and rat〔J〕.Izv Akad Nauk Ser Biol，2004;31(6):659-64.

10 Herring M，Gardner A，Glover J.A single-staged technique for seeding vascular grafts with autogenous endothelium〔J〕.Surgery，1978;84(4):498-504.

11 Takizawa S.Differentiation of adult bone marrow cells into neurons and endothelial cells in rat brain after stroke in the presence of cytokines〔J〕.Rinsho Shinkeigaku，2003;43(11):830-1.

12 Wang YQ，Wang M，Zhang P，el al.Effect of transplanted mesenchymal stem cells from rats of different ages on the improvement of heart function after acute myocardial infarction〔J〕.Chin Med J(Engl)，2008;121(22):2290-8.

13 Bidarra SJ，Barrias CC，Barbosa MA，et al.Phenotypic and proliferative modulation of human mesenchymal stem cells via crosstalk with endothelial cells〔J〕.Stem Cell Res，2011;7(3):186-97.

14 李玉玲，李 紅，胡明均，等.腺病毒裝載人vegf-165基因轉(zhuǎn)染的間充質(zhì)干細(xì)胞對下肢缺血性壞死大鼠模型促血管新生的作用〔J〕.中國實驗血液學(xué)雜志，2010;18(6):1568-73.