王紅陽(yáng) 王 袁 王宏麗 郝小惠 劉和亮， (河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河北 唐山 063000)

支氣管哮喘是由多種細(xì)胞(如嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和氣道上皮細(xì)胞等)和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病。它是呼吸系統(tǒng)的常見(jiàn)病和多發(fā)病，但其發(fā)病機(jī)制至今尚不十分清楚〔1〕?，F(xiàn)有的藥物并不能徹底治療哮喘，因此世界衛(wèi)生組織把哮喘確定為終身治療性疾病〔2〕。隨著細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)展，人們發(fā)現(xiàn)許多與氣道炎癥有關(guān)的細(xì)胞因子都參與了哮喘的病理生理過(guò)程，其中IL-12扮演了極為重要的角色，但它在哮喘免疫治療過(guò)程中發(fā)揮作用的具體機(jī)制還不清楚。本研究旨在觀察IL-12對(duì)哮喘小鼠體內(nèi)腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-10、一氧化氮(NO)和IgE水平的影響，探討其治療哮喘的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)6～8周齡的C57BL/6雄性小鼠45只，平均體重18～22 g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):CSXK京2009-0004。

1.2 主要試劑與儀器 OVA(A5503，美國(guó) Sigma公司)，氫氧化鋁(天津市大茂化學(xué)試劑廠)，rmIL-12(210-12，美國(guó)PEROTECH EC公司)，小鼠 TNF-α、IL-10、NO 和 IgE ELISA 試劑盒(美國(guó)R＆B公司);402AI超聲霧化器(江蘇魚(yú)躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司);自制透明霧化吸入箱(30 cm×20 cm×10 cm);酶標(biāo)儀(瑞士帝肯公司);低溫高速離心機(jī)(3K30，美國(guó) Sigma公司);電熱恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9052，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組 正常飼養(yǎng)7 d，使小鼠適應(yīng)環(huán)境后，采用隨機(jī)數(shù)字表法將45只小鼠隨機(jī)分成3組，即rmIL-12組20只，哮喘組20只，對(duì)照組5只。前兩組又各自分為末次激發(fā)后1 d，2 d，4 d，8 d 四個(gè)亞組(每個(gè)亞組:n=5)。

1.4 小鼠模型的建立 參照文獻(xiàn)〔3〕方法建立哮喘小鼠模型。哮喘組和 rmIL-12組小鼠分別于第 0、7和 14天腹腔注射0.2 ml OVA致敏液(含OVA 20 μg和氫氧化鋁2 mg的PBS溶液)進(jìn)行致敏，第21～27天將兩組小鼠依次置于一自制透明的不完全密閉的有機(jī)玻璃盒內(nèi) (容積為30 cm×20 cm×10 cm)，以1%OVA溶液20 ml(含0.2 g OVA的PBS溶液 )進(jìn)行霧化激發(fā)，每天一次，每次30 min，連續(xù)7 d。rmIL-12組在哮喘組的基礎(chǔ)上，每次激發(fā)前30 min，每只小鼠腹腔注射0.1 ml含0.14 μg rmIL-12的PBS溶液進(jìn)行治療。對(duì)照組用等量的PBS溶液進(jìn)行致敏和激發(fā)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，密切觀察各組小鼠的一般情況，包括進(jìn)食，活動(dòng)、呼吸、體重、精神狀態(tài)以及抓撓顏面部等過(guò)敏行為的變化，并做相應(yīng)的記錄。

1.5 標(biāo)本采集和處理 對(duì)照組小鼠在末次激發(fā)后2 d處死，哮喘組和 rmIL-12組小鼠在末次激發(fā)后1、2、4、8 d分四個(gè)時(shí)間段處死。所有小鼠通過(guò)彎鑷摘取一側(cè)眼球的方式進(jìn)行采血，離心后的血漿-70℃儲(chǔ)存待測(cè)NO和IgE水平。然后仰臥位固定小鼠，打開(kāi)胸腔，結(jié)扎右肺下葉待做病理。剪開(kāi)小鼠頸部皮膚，暴露頸前氣管，在環(huán)狀軟骨上方做一橫行切口，給兩側(cè)支氣管肺泡同時(shí)進(jìn)行灌洗。每次緩慢注入PBS 1 ml，重復(fù)操作3次，3次獲得的BALF混勻后離心，收集其上清液，-70℃冰箱儲(chǔ)存用于檢測(cè)IL-10、TNF-α含量。細(xì)胞沉淀用于細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)分類(lèi)計(jì)數(shù)。最后剪下結(jié)扎的右肺下葉用于HE染色觀察炎癥反應(yīng)情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。首先對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，各組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，數(shù)據(jù)以s表示。組間比較采用單因素方差分析法(One-way ANOVA)。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠在激發(fā)過(guò)程中的一般情況 致敏階段:各組小鼠在進(jìn)食、活動(dòng)、精神狀態(tài)、呼吸、體重、大小便等方面均未見(jiàn)明顯的異常和組間差別。激發(fā)階段:對(duì)照組小鼠激發(fā)前后上述指標(biāo)無(wú)明顯異常。哮喘組小鼠激發(fā)后的精神狀態(tài)較致敏階段差，食欲下降，體重減輕。激發(fā)過(guò)程中，在霧化吸入OVA 5 min左右后呼吸便加深加快，甚至出現(xiàn)點(diǎn)頭呼吸，頻繁搔抓顏面皮毛，前肢縮抬，縮頭弓背等哮喘急性發(fā)作表現(xiàn)，繼而小鼠俯伏不動(dòng)。與哮喘組相比，rmIL-12組小鼠上述哮喘癥狀明顯減輕。

2.2 各組小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)和EOS百分比的動(dòng)態(tài)變化哮喘組小鼠的細(xì)胞總數(shù)在第1天達(dá)高峰，EOS百分比在第2天達(dá)高峰。rmIL-12組小鼠的細(xì)胞總數(shù)和 EOS百分比在1、2和4 d隨時(shí)間延長(zhǎng)其水平逐漸降低，但至第8天時(shí)都略有回升。與相同時(shí)間段的哮喘組相比，rmIL-12組的細(xì)胞總數(shù)，EOS百分比明顯降低，在末次激發(fā)后1、2和4 d差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)和EOS百分比的動(dòng)態(tài)變化(s，n=5)

表1 各組小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)和EOS百分比的動(dòng)態(tài)變化(s，n=5)

與對(duì)照組比較:1)P＜0.05;與哮喘組比較:2)P＜0.05，下表同

組別 細(xì)胞總數(shù)(×104/ml)EOS百分比(%)對(duì)照組 19.47±1.87 0.05±0.04哮喘組 1 d 115.84±7.15 11.90±1.38 2 d 106.12±9.791) 32.57±3.981)4 d 58.15±9.57 9.94±1.03 8 d 35.86±1.98 6.42±0.69治療組 1 d 47.74±3.582) 7.19±0.762)2 d 29.54±3.992) 2.33±0.492)4 d 26.19±4.052) 0.45±0.202)8 d 31.52±3.85 5.42±0.59

2.3 各組小鼠TNF-α、IL-10、NO和 IgE水平的動(dòng)態(tài)變化 哮喘組小鼠的TNF-α、NO、IgE在第2天達(dá)高峰，以后逐日下降，至第8 d時(shí)仍然高于對(duì)照組水平，IL-10隨時(shí)間延長(zhǎng)其水平逐漸降低，后者至第8天時(shí)略有回升，出現(xiàn)釋放高峰的延遲。rmIL-12組與相同時(shí)段的哮喘組相比，TNF-α、NO、IgE水平明顯降低，IL-10水平明顯升高，TNF-α和NO在1、2，4 d和8 d差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，IL-10在1、4和8 d具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜ 0.05)，IgE 在2 d和4 d具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜ 0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠BALF中TNF-α、IL-10及血漿NO、IgE水平動(dòng)態(tài)變化(s，n=5)

表2 各組小鼠BALF中TNF-α、IL-10及血漿NO、IgE水平動(dòng)態(tài)變化(s，n=5)

組別 BALF(pg/ml)TNF-α IL-10血漿(μg/ml)NO IgE對(duì)照組 196.07±14.39 206.01±6.29 9.41±0.61 3.41±0.26哮喘組1 d 324.29±9.20 171.10±3.30 20.31±0.80 6.04±0.28 2 d 394.32±12.631)149.20±4.961)25.16±0.721)7.28±0.291)4 d 340.76±10.32 123.27±5.41 22.05±0.62 5.99±0.18 8 d 270.86±11.90 120.24±3.70 20.45±0.72 4.98±0.23治療組1 d 302.92±6.002)121.34±4.832)17.74±0.572) 5.78±0.23 2 d 268.19±9.702)152.41±3.63 13.71±0.662)5.45±0.172)4 d 249.50±6.982)153.78±5.122)13.35±1.162)5.22±0.152)8 d 247.00±8.122)156.09±4.582)12.85±1.002) 4.95±0.19

2.4 肺組織病理改變 對(duì)照組小鼠的肺泡和中小細(xì)支氣管結(jié)構(gòu)正常:肺泡上皮細(xì)胞排列規(guī)整，支氣管管腔和肺泡腔內(nèi)無(wú)異物，管壁和平滑肌厚度正常。血管、氣道周?chē)匆?jiàn)明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。哮喘組小鼠的肺泡腔內(nèi)充滿滲出液，肺泡間隔變寬。支氣管的管壁杯狀細(xì)胞增生，管壁增厚，管腔縮小且不規(guī)則，可見(jiàn)黏液栓。支氣管管壁、血管周?chē)头伍g質(zhì)內(nèi)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，主要是嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞等。rmIL-12組與哮喘組相比，小鼠的支氣管黏膜上皮和肌層均完好，細(xì)支氣管無(wú)明顯痙攣、收縮，管腔較為規(guī)則。肺泡管和肺泡壁結(jié)構(gòu)受損程度明顯輕于哮喘組，支氣管管腔及肺泡腔中黏液栓明顯減少。肺組織及血管周?chē)仔约?xì)胞浸潤(rùn)程度明顯減輕。見(jiàn)圖1。

圖1 小鼠肺組織病理結(jié)果(HE，×100)

3 討論

哮喘是呼吸系統(tǒng)的常見(jiàn)病和多發(fā)病，其發(fā)病機(jī)制迄今仍未完全闡明。目前公認(rèn)的是哮喘的反復(fù)發(fā)作是由于炎癥介質(zhì)、炎性細(xì)胞之間相互調(diào)控，相互制約的失常，從而導(dǎo)致炎癥-上皮細(xì)胞損傷-氣道重構(gòu)的惡性循環(huán)〔4～6〕。因此，炎性介質(zhì)的研究對(duì)闡明哮喘的發(fā)病機(jī)制具有極為重要的意義。IL-12是細(xì)胞免疫中一類(lèi)重要的調(diào)節(jié)因子，它屬于Th1型細(xì)胞因子，主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫過(guò)程〔7，8〕。IL-12幾乎完全由活化的抗原提呈細(xì)胞(包括樹(shù)突狀細(xì)胞，單核/巨噬細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞)分泌〔9〕，它具有多種生物學(xué)功能在哮喘發(fā)病過(guò)程中具有保護(hù)作用:①在體外可以通過(guò)干擾素依賴機(jī)制和干擾素非依賴機(jī)制抑制B細(xì)胞合成IgE，從而調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答平衡;②轉(zhuǎn)變B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的類(lèi)型，降低 IgG1水平，提升 IgG2a，IgG2b，IgG3水平〔10〕;③抑制嗜酸性粒細(xì)胞向氣道內(nèi)浸潤(rùn)，抑制肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞合成Th2型細(xì)胞因子，同時(shí)抑制其脫顆粒反應(yīng);④和局部產(chǎn)生的IFN-γ協(xié)同作用，共同降低過(guò)敏原導(dǎo)致的氣道高反應(yīng)性。IL-10是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的具有抗炎作用的細(xì)胞因子。它幾乎能夠抑制所有促炎因子的合成與釋放，包括一些在哮喘發(fā)病過(guò)程中過(guò)度表達(dá)的細(xì)胞因子(如 TNF-α、IL-4、IL-5等)〔11〕。它還能通過(guò)抑制嗜酸粒細(xì)胞表達(dá)CD40從而發(fā)揮抗過(guò)敏效應(yīng)。TNF-α是由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種具有廣泛生物學(xué)活性的多肽類(lèi)細(xì)胞因子。它可引起支氣管的高反應(yīng)性〔12〕。NO由一氧化氮合酶(NOS)催化左旋精氨酸(L-精氨酸)與氧分子而成。在某些病理?xiàng)l件下，NO的大量釋放會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，損壞組織細(xì)胞，擴(kuò)張支氣管黏膜血管，增強(qiáng)毛細(xì)血管的滲出及炎癥介質(zhì)的釋放〔13，14〕。除此之外，NO還能夠促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞的趨化，并抑制其凋亡〔15〕，因而是哮喘的危險(xiǎn)因素。IgE是由B細(xì)胞合成的一種可介導(dǎo)Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)的免疫球蛋白，血清總IgE水平的增高和氣道內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)分別是支氣管哮喘的主要免疫學(xué)特征和病理學(xué)特征。因此，由上可以得知IL-10、IL-12是哮喘發(fā)生時(shí)的保護(hù)因子，TNF-α，NO是哮喘的危險(xiǎn)因子。

本研究結(jié)果顯示，IL-12對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥有良好的治療作用。IL-12正是通過(guò)抑制炎癥介質(zhì)TNF-α、NO的釋放同時(shí)促進(jìn)抑炎因子IL-10的合成從而使炎癥反應(yīng)與抗炎反應(yīng)重新回復(fù)平衡。同時(shí)各類(lèi)研究也表明IL-12在治療哮喘方面有相當(dāng)不錯(cuò)的研究前景。國(guó)內(nèi)學(xué)者用能產(chǎn)生活性IL-12的乳球菌滴鼻治療哮喘小鼠，發(fā)現(xiàn)Th2型細(xì)胞因子的合成明顯受到抑制，氣道高反應(yīng)性和肺內(nèi)炎癥明顯減輕，局部細(xì)胞免疫功能低下的狀態(tài)明顯改善〔16〕。Li等〔17〕發(fā)現(xiàn)在卵白蛋白激發(fā)時(shí)肌內(nèi)注射rm IL-12可減輕杯狀細(xì)胞的增生，抑制黏液的分泌。

綜上所述，白細(xì)胞總數(shù)、EOS百分比、TNF-α、IL-10、NO 和IgE水平綜合的動(dòng)態(tài)變化可作為反映支氣管哮喘氣道炎癥的重要指標(biāo)，以IL-12為靶點(diǎn)的治療方案也為臨床上哮喘的治療帶來(lái)了新希望，有望成為治療哮喘的新途徑。

1 Kaiko GE，F(xiàn)oster PS.New insights into the generation of Th2 immunity and potential therapeutic targets for the treatment of asthma〔J〕.Curr Opin Allergy Clin Immunol，2011;11(1):39-45.

2 Patil SU，Long AA.The usefulness of biomarkers of airway inflammation in managing asthma〔J〕.Allergy Asthma Proc，2010;31(4):259-68.

3 唐順廣，周瑞祥，賁素琴，等.急性支氣管哮喘小鼠肺組織水通道蛋白1表達(dá)的變化及乙酰唑胺對(duì)水通道蛋白1表達(dá)的影響〔J〕.中華哮喘雜志(電子版)，2009;3(5):326-37.

4 Baran CP，Opalek JM，McMaken S，et al.Important roles for macrophage colony-stimulating factor，CC chemokine ligand 2，and mononuclear phagocytes in the pathogenesis of pulmonary fibrosis〔J〕.Am J Respir Crit Care Med，2007;176(1):78-89.

5 McLachlan CR，Poulton R，Car G，et al.Adiposity，asthma，and airway inflammation〔J〕.J Allergy Clin Immunol，2007;119(3):634-9.

6 Sabroe I，Parker LC，Dockrell DH，et al.Targeting the networks that underpin contiguous Immunity in asthma and chronic obstructive pulmonary disease〔J〕.Am J Respir Crit Care Med，2007;175(4):306-11.

7 Pini M，Sennello JA，Cabay RJ，et al.Effect of diet-induced obesity on acute pancreatitis induced by administration of interleukin-12 plus interleukin-18 in mice〔J〕.Obesity(Silver Spring)，2010;18(3):476-81.

8 Del Vecchio M，Bajetta E，Canova S，et al.Interleukin-12:biological properties and clinical application〔J〕.Clin Cancer Res，2007;13(16):4677-85.

9 Suzuki M，Matsumoto T，Ohta N，et al.Intranasal CpG DNA therapy during allergen exposure in allergic rhinitis〔J〕.Otolaryngol Head Neck Surg，2007;136(2):246-51.

10 Klinke DJ 2nd.A multiscale systems perspective on cancer，immunotherapy，and Interleukin-12〔J〕.Mol Cancer，2010;9:242.

11 Barnes PJ.The cytokine network in asthma and chronic obstructive in asthma and chronic obstructive pulmonary disease〔J〕.J Clin Invest，2008;118(11):3546-56.

12 Brightling C，Berry M，Amrani Y，et al.Targeting TNF-αlpha:a novel therapeutic approach for asthma〔J〕.J Allergy Clin Immunol，2008;121(1):5-10.

13 Pacher P，Beckman JS，Liaudet L，et al.Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease〔J〕.Physiol Rev，2007;87(1):315-424.

14 Heffler E，Guida G，Marsicop P，et al.Exhaled nitric oxide as a diagnostic test for asthma in rhinitic patients with asthmatic symptoms〔J〕.Respir Med，2006;100(11):1981-7.

15 Lex C，F(xiàn)erreira F，Zacharasiewicz A，et al.Airway eosinophilia in children with severe asthma:predictive values of noninvasive test〔J〕.Am J Respir Crit Care Med，2006;174(12):1286-91.

16 Wu C，Yang G，Bermúdez-Humarán LG，et al.Immunomodulatory effects of IL 12 secreted by Lactococcus lactis on Th1/Th2 balance in ovalbumin(OVA)induced asthma modelmice〔J〕.Int Immunopharmacol，2006;6(4):610-5.

17 Li H，Xie Q，Wang H，et al.Intramuscular delivery of mIL-12 gene reduces the expression of CD44/CD49d on pulmonary leucoytes and inhibits ovalbumin-induced airway hyperreactivity〔J〕.Inflamm Res，2008;57(1):11-7.