王 雅 趙 星 馬從乾 楊 軻 (南陽市中心醫(yī)院血管外科，河南 南陽 473000)

抑癌基因功能喪失和癌基因表達是細胞癌變的分子基礎(chǔ)〔1，2〕。Hiwi基因為Piwi基因家族的一員，是小RNA復(fù)合體的基本組成成員之一〔3〕，當小RNA與具有同源序列的靶mRNA或靶DNA結(jié)合后，Hiwi家族蛋白誘導(dǎo)組蛋白或區(qū)域DNA甲基化，刪除部分DNA序列、降解mRNA、抑制翻譯活動從而發(fā)揮基因沉默作用，進而誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生〔4～6〕。研究發(fā)現(xiàn)，Hiwi基因在許多腫瘤中表達升高，而甲狀腺乳頭狀癌(PTC)中Hiwi mRNA及蛋白的表達及其相關(guān)性，至今尚未見報道。本研究旨在探討Hiwi mRNA及蛋白的表達與PTC發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 組織標本 50例PTC及其切緣與癌灶相隔2 cm的非癌上皮(NCE)組織，均經(jīng)病理證實，分別取自2009年1月至2013年1月南陽市中心醫(yī)院普外科手術(shù)切除標本。所有病例術(shù)前均未接受化療、放療及其他免疫治療。50例患者中，男15例，女35例，年齡13～77歲，中位年齡45歲。TNM分期(按2002年國際抗癌聯(lián)盟公布的標準進行)，Ⅰ期6例，Ⅱ期22例，Ⅲ期18例，Ⅳ期4例;病理分級Ⅰ級38例，Ⅱ級12例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性32例，陰性18例。

1.2 組織總RNA及組織蛋白的提取 取80 mg組織及1 ml trizol放入EP管并置于超聲組織破碎儀中，按照trizol說明書提取樣本總RNA。紫外分光光度儀測定其吸光度，計算其濃度，并且在1%的瓊脂糖電泳中檢測其完整性。取80 mg組織及1 ml蛋白組織裂解液(RIPA)和10 μl蛋白酶抑制劑(PMSF)放入EP管并置于超聲組織破碎儀中，之后按照RIPA裂解液說明書提取組織蛋白。二喹啉甲酸(BCA)法測蛋白濃度。

1.3 RT-PCR 取 A260/280 為 1.8 ～2.0 的 2 μg總 RNA 按照Prime ScriptTM 1 st Strand cDNA Synthesis Kit說明(大連寶生物公司)合成cDNA。用β-actin用內(nèi)參照進行PCR擴增。引物設(shè)計為:Hiwi基因的引物序列:上游5'-AGAGGAACAGGAGGAAC-3'，下游5'-TCACATCCTCTCCATTCCGG-3'擴增長度 428 bp。β-actin的引物序列:上游5'-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3'，下游5'-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3'擴增長度230 bp。RTPCR 反應(yīng)體系為 25 μl。TaKaRa Taq HS 0.25 μl;10×PCR Buffer 5 μl;dNTP Mixture 4 μl;Forward Primer 0.5 μl;Reverse Primer 0.5 μl;模板 2 μl;其余補水至 25 μl。循環(huán)參數(shù):94℃ 5 min 預(yù)變性，94℃變性 1 min，50℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，30 個循環(huán)，72℃終延伸7 min。取PCR參物5 μl在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，紫外燈下觀察并照相。使用Quantity-one軟件計算各個樣本Hiwi表達水平，表達量的相對值=待測基因擴增條帶的灰度值/β-actin基因擴增條帶的A值。

1.4 Western印跡取20 μg的組織總蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳80 V，待蛋白至分離膠后120 V。濕轉(zhuǎn)220 mA，2 h將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。5%的脫脂奶粉封閉1 h。加入1∶1 000的1×TBS稀釋的一抗Hiwi(Santa Cruz公司山羊抗人多克隆抗體)，4℃過夜。1×Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗膜3次，10 min/次。加入1∶3 000的1×TBST稀釋的二抗(北京康為世紀的兔抗山羊 lgG-HRP)，室溫1 h。1×TBST洗膜3次，10 min/次。加入1∶1 000的1×TBST稀釋的一抗(北京康為世紀的鼠抗人內(nèi)參 β-actin一抗)，4℃過夜。1×TBST洗膜3次，10 min/次。加入1∶3 000的1×TBST稀釋的二抗(北京康為世紀公司的山羊抗鼠 lgG-HRP)，室溫1 h。1×TBST洗膜3次，10 min/次。待暗室加入電化學(xué)熒光法(ECL)發(fā)光劑曝光，顯影。使用Quantity-one軟件計算各個樣本Hiwi蛋白表達水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進行分析，數(shù)據(jù)采用s表示，對甲狀腺乳頭狀癌和正常組織的mRNA和蛋白表達量進行配對t檢驗，對臨床病理因素間的表達進行χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 癌旁組織與PTC中Hiwi mRNA及蛋白的表達 在癌組織中均可檢測到mRNA的表達，Hiwi mRNA在PTC組織中的表達量相對值(0.92±0.02)高于正常甲狀腺組織(0.31±0.03)(P＜0.05)。在癌組織中均可檢測到蛋白的表達，Hiwi蛋白在PTC組織中的積分光密度值(1 982.00±137.63)高于正常甲狀腺組織中(982.01±125.32)(P＜0.05)。見圖 1，圖 2。

2.2 PTC中Hiwi mRNA及蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系Hiwi mRNA的表達與患者的病理分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05);Hiwi蛋白表達與患者的TNM分期、病理分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05);兩者均與患者的年齡、性別、腫瘤大小無關(guān)。見表1。

圖1 Hiwi mRNA在PTC及其癌旁組織中的表達

2.3 Hiwi基因mRNA與蛋白表達的相關(guān)性 50例PTC中，Hiwi mRNA的表達大多伴隨Hiwi蛋白的表達，兩者具有相關(guān)性(P＜0.05)。其中Hiwi蛋白表達伴隨RT-PCR表達8例，Hiwi表達伴隨RT-PCR缺失18例，Hiwi蛋白缺失伴隨RT-PCR表達19例，Hiwi蛋白缺失伴隨RT-PCR缺失5例。

圖2 Hiwi蛋白在PTC及其癌旁組織中的表達

表1 PTC組織Hiwi基因mRNA、蛋白表達陽性率與臨床病理特征的關(guān)系〔n(%)〕

3 討論

Hiwi基因位于12號染色體長臂〔3〕。Hiwi基因內(nèi)含子為3.6 kb，編碼相對分子質(zhì)量為98.5 kD的蛋白，這個蛋白由861個氨基酸組成，與Piwi有52%的同源性，像其他Piwi基因家族成員一樣也具有中部保守的結(jié)構(gòu)域和C末端的Piwi box結(jié)構(gòu)域。Hiwi是小RNA復(fù)合體的基本組成成員之一，當小RNA與具有同源序列的靶mRNA或靶DNA結(jié)合后，Hiwi家族蛋白則誘導(dǎo)組蛋白或區(qū)域DNA甲基化，以刪除部分DNA序列、降解mRNA、抑制翻譯活動從而發(fā)揮基因沉默作用，進而誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生。

目前有研究報道Runx3基因在肝癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、結(jié)腸癌等腫瘤中表達〔7～10〕。但在PTC中Hiwi基因轉(zhuǎn)錄表達的影響國內(nèi)外尚未見文獻報道。從比較基因組學(xué)的研究觀點，PTC的發(fā)生、發(fā)展很可能涉及到Hiwi基因的表達改變。

本研究結(jié)果表明Hiwi mRNA的表達參與了PTC的發(fā)生和發(fā)展。這與根據(jù)比較基因組學(xué)研究推測Hiwi可能在PTC中表達失活的結(jié)論相符。另外，本研究也提示Hiwi mRNA表達與PTC的惡性程度及預(yù)后有關(guān)，可能是一晚期事件。Western印跡結(jié)果更進一步說明，Hiwi蛋白的表達參與了PTC的發(fā)生與發(fā)展。

Hiwi基因在PTC中存在異常表達，在其發(fā)生和發(fā)展中起到一定的作用。Hiwi基因有可能成為PTC的生物學(xué)指標，檢測Hiwi蛋白的表達有助于PTC的篩查、早期診斷和預(yù)后判斷。

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