夏 銘 潘 雪(貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院，貴陽(yáng) 貴州 550002)

糖尿病是以糖代謝紊亂為主要表現(xiàn)的內(nèi)分泌疾病，源于糖的來(lái)源與去路失去了動(dòng)態(tài)的平衡，導(dǎo)致胰腺功能障礙，胰島素分泌減少。胰島素由胰島β細(xì)胞合成和分泌，經(jīng)血循環(huán)到達(dá)體內(nèi)各組織器官的靶細(xì)胞，與特異受體結(jié)合并引發(fā)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝效應(yīng)。關(guān)注胰島β細(xì)胞的保護(hù)和再生作用的研究成為目前糖尿病防治工作的重點(diǎn)方向。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 構(gòu)建生殖系穩(wěn)定整合目的基因的轉(zhuǎn)基因斑馬魚系F2代。進(jìn)入北京愛(ài)生斑馬魚全自動(dòng)養(yǎng)殖系統(tǒng)，按照Westerfield〔1〕方法喂養(yǎng)4 w后進(jìn)行規(guī)律交配訓(xùn)練，以質(zhì)量穩(wěn)定的胚胎作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、E.coli DH5α感受態(tài)、凝膠純化試劑盒、質(zhì)粒小規(guī)模抽提試劑盒購(gòu)自Takra公司;In Situ Cell Death Detection Kit、DIG標(biāo)記試劑盒購(gòu)自Roche公司;SP6 RNA polymerase、T7 RNA polymerase、T3 RNA polymerase、RNA柱純化試劑盒購(gòu)自Ambion公司;levamisol、甲硝唑購(gòu)自Sigma公司。Western Blotting Chemiluminescence Luminol Reagent購(gòu)自Santa Cruz公司。其他的常規(guī)生化及分子生物學(xué)試劑均購(gòu)自上海生工生物工程公司。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器 斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)(北京ESEN Environ Science)、生化培養(yǎng)箱(青島Hair)、梯度PCR儀和臺(tái)式冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf)、多功能電泳儀及水平電泳槽和UVP凝膠成像儀(上海復(fù)日科技)、雜交爐(美國(guó)Boekel)、蔡斯體視熒光顯微鏡及顯微攝像系統(tǒng)(德國(guó)ZEISS Stereo Discovery.V20)。

1.4 全胚胎原位雜交(WISH)分別以構(gòu)建好的斑馬魚胰島素cDNA和GFP-PCS2+重組質(zhì)粒作為模版，體外轉(zhuǎn)錄合成地高辛標(biāo)記的反義mRNA探針;收集固定INS-nfsB-tg系F2代轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎，脫水后復(fù)水化處理，分別以胰島素和綠色熒光蛋白(GFP)的mRNA探針于雜交緩沖液65℃雜交過(guò)夜。斑馬魚胚胎在封閉液中封閉1～3 h。然后加入抗地高辛抗體4℃處理過(guò)夜。之后用BCIP/NBT溶液處理胚胎30～60 min，顯微鏡下觀察顯色情況，然后用1 ml磷酸鹽緩沖液(PBST)3次快速漂洗終止顯色反應(yīng)。當(dāng)熒光蛋白與內(nèi)源性胰島素表達(dá)共定位，可證實(shí)綠色熒光蛋白對(duì)胰島β細(xì)胞可靠的示蹤性。

1.5 Western印跡技術(shù) 取20個(gè)斑馬魚胚胎于1.5 ml Eppendorf管中，去卵黃囊緩沖液(55 mmol/L NaCl，1.8 mmol/L KCl，1.25 mmol/L NaHCO3)，分離斑馬魚胚胎的卵黃囊，反復(fù)清洗2次后加入RIPA裂解液和PMSF超聲裂解，酶標(biāo)儀定量。取等量蛋白樣品加等體積的上樣緩沖液煮沸10 min，10%SDSPAGE電泳進(jìn)行條帶分離，SDS-PAG凝膠上的蛋白在 Mini Trans-Blot Cell(BioRad)中電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(OPTITRAN BA-S，Schleicher＆ Schuell，Keene，NH，USA)。封閉液 4℃封閉過(guò)夜，加入一抗，室溫孵育1 h，PBST清洗后，加入二抗，室溫孵育1 h，按試劑說(shuō)明書用Western Blotting Chemiluminescence Luminol Reagent進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影，并用X光片記錄影像。為了檢測(cè)活體熒光蛋白表達(dá)效率，通過(guò)Western印跡技術(shù)檢測(cè)內(nèi)源綠色蛋白的表達(dá)水平來(lái)測(cè)定甲硝唑破壞胰島β細(xì)胞的效率。

1.6 免疫熒光 收集胚胎用4%多聚甲醛4℃固定過(guò)夜。胚胎進(jìn)行脫水和復(fù)水，-20℃的甲醇過(guò)夜。-20℃預(yù)冷丙酮處理10 min，PBST清洗胚胎，TritonX-100室溫透化30 min，阻滯液室溫封閉1 h，加入特異性一抗4℃孵育過(guò)夜，PBST室溫清洗3次后加入二抗，室溫孵育1 h，去除二抗，PBST清洗降低背景，Tunnel反應(yīng)液37℃孵育2 h，PBST清洗2次，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。采用全胚胎免疫熒光的方法檢測(cè)甲硝唑作用后綠色熒光蛋白表達(dá)效率明顯降低。同時(shí)運(yùn)用TUNEL試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

2 結(jié)果

2.1 化學(xué)方法破壞胰島β細(xì)胞 通過(guò)顯微注射將轉(zhuǎn)基因構(gòu)件注入斑馬魚體內(nèi)，篩選并獲得可以穩(wěn)定遺傳的表達(dá)綠色熒光蛋白的胰島β細(xì)胞的F2代轉(zhuǎn)基因斑馬魚系(圖1a)。運(yùn)用INS探針和GFP探針，通過(guò)全胚胎原位雜交實(shí)驗(yàn)證實(shí)了綠色熒光蛋白與胰島β細(xì)胞表型共定位(圖1b)。Mt2孵育48 h后可見活體熒光蛋白表達(dá)量明顯降低，同時(shí)胚胎發(fā)育情況和甲硝唑?qū)ε咛サ亩拘詻](méi)有明顯影響(圖1c)。

2.2 Western印跡技術(shù)證實(shí)胰島β細(xì)胞的破壞效果 熒光顯微鏡下選取甲硝唑化學(xué)破壞48 h后的胚胎，綠色熒光蛋白表達(dá)明顯減低的活體胚胎，熒光蛋白表達(dá)效率同時(shí)減低，且未在野生型組檢測(cè)到熒光蛋白的表達(dá)。該結(jié)果證實(shí)了甲硝唑確實(shí)能靶向破壞胰島β細(xì)胞，并能夠通過(guò)活體熒光觀察方便地識(shí)別(圖2)。

2.3 全胚胎免疫熒光檢測(cè) 甲硝唑組GFP熒光蛋白明顯降低同時(shí)，細(xì)胞的凋亡也比對(duì)照組明顯增多(圖3)。

圖1 化學(xué)方法破壞胰島β細(xì)胞

圖2 Western印跡技術(shù)檢測(cè)熒光蛋白表達(dá)效率

圖3 全胚胎免疫熒光檢測(cè)綠色熒光蛋白表達(dá)

3 討論

轉(zhuǎn)基因技術(shù)為人類疾病動(dòng)物模型研究提供了一種新的方法〔2〕，通過(guò)人為改造動(dòng)物基因組，能在活體水平上研究人類疾病基本發(fā)生的分子機(jī)制、組織病理狀況、治療的效果等，目前應(yīng)用于現(xiàn)代生物學(xué)的各個(gè)方面。

研究利用斑馬魚這一模式生物〔3〕，因其常年產(chǎn)卵，一次交配能獲得數(shù)百個(gè)胚胎，胚胎在體外受精，發(fā)育早期呈透明，易于操作，發(fā)育過(guò)程可被直接連續(xù)觀察，方便進(jìn)行大規(guī)模的化學(xué)突變型篩選，定位克隆和活體候選藥物篩選等諸多優(yōu)勢(shì)。前期研究中，通過(guò)顯微注射的方法，將轉(zhuǎn)基因構(gòu)件整合至斑馬魚基因組中，構(gòu)建了特異性標(biāo)記胰島β細(xì)胞為“綠色”細(xì)胞的胰島β細(xì)胞轉(zhuǎn)基因斑馬魚系。在轉(zhuǎn)基因斑馬魚的胚胎養(yǎng)殖水中加入甲硝唑，通過(guò)硝基還原酶還原甲硝唑的硝基成一種細(xì)胞毒成分〔4〕，既不影響胚胎發(fā)育，也不會(huì)引起胚胎過(guò)度畸形和大量死亡，同時(shí)隨著基因的表達(dá)，這種細(xì)胞毒性可以靶向性作用于細(xì)胞的DNA代謝過(guò)程，抑制細(xì)胞的脫氧核糖核酸的合成，干擾細(xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，獲得一種化學(xué)遺傳學(xué)破壞胰島β細(xì)胞的活體斑馬魚疾病模型。

不同類型糖尿病的病因不盡相同，胰島β細(xì)胞不同程度破壞的核心病機(jī)引起了廣泛關(guān)注。更多研究集中在保護(hù)、再生和移植胰島β細(xì)胞〔5，6〕，期望可以獲得糖尿病治療的有效方法。

1 Westerfield M.The zebrafish book:a guide for the laboratory use of Zebrafish(Danio rerio)〔M〕.Eugene:University of Oregon Press，1995:56-60.

2 Wadsworth JD，Asante EA，Collinge J.Contribution of transgenic models to understanding human prion disease〔J〕.Neuropathol Appl Neurobiol，2010;36(7):576-97.

3 Jorqens K，Hillebrands JL，Hammes HP，et al.Zebrafish:a model for understanding diabetic complications〔J〕.Exp Clin Endocrinol Diabetes，2012;120(4):186-7.

4 Pisharath H，Parsons MJ.Nitroreductase-mediated cell ablation in transgenic zebrafish embryos〔J〕.MethodsMol Biol，2009;546:133-43.

5 Stendahl JC，Kaufman DB，Stupp SI.Extracellular matrix in pancreatic islets:relevance to scaffold design and transplantation〔J〕.Cell Transplant，2009;18(1):1-12.

6 Cantarelli E，Citro A，Marzorati S，et al.Murine animal models for preclinical islet transplantation:no model fits all(research purposes)〔J〕.Islets，2013;5(2):79-86.