路 燦 徐惠君 賈勇圣 佟仲生

受體相互作用蛋白3（receptor-interacting pro? tein 3，RIP3）是受體相互作用蛋白家族的一員，是腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死之間的分子開關(guān)，在凋亡受到抑制時(shí)，RIP3可以通過調(diào)節(jié)能量代謝而介導(dǎo)細(xì)胞壞死[1]。它廣泛表達(dá)于胚胎和大量成熟組織中，但在一些腫瘤細(xì)胞中低表達(dá)，如宮頸癌細(xì)胞HeLa，骨肉瘤細(xì)胞U2OS等[2]。本研究擬構(gòu)建RIP3基因的真核表達(dá)載體，建立穩(wěn)定過表達(dá)RIP3基因的MCF7細(xì)胞系，并證實(shí)其融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)、定位及介導(dǎo)壞死的功能，為進(jìn)一步探討程序性壞死的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Phusion Hot StartⅡDNA polymerase、Pierce BCA Protein Assay Kit蛋白濃度測(cè)定試劑盒購自Thermo公司；限制性內(nèi)切酶NheⅠ、NotⅠ購自Fermentas公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒，In-fusion連接酶，E.coliDH5α菌株，質(zhì)粒提取試劑盒均購自Takara公司；Dulbecco’s Modi fi ed Eagle’s Medium（DMEM）培養(yǎng)液購自neuron-biotech公司；胎牛血清（FBS）購自蘭州民海生物工程有限公司；青鏈霉素（PS）混合液購自北京Solarbio Science and Technology公司；0.25%胰酶購自天津百若克醫(yī)藥生物技術(shù)有限公司；聚凝胺、殺稻瘟菌素均購自Santa Cruz公司，RIP3鼠兔源單克隆抗體購自天津三箭生物技術(shù)有限公司。pCDH-CMV-MCS-EF1-blastici?din-mCherry載體為本實(shí)驗(yàn)室已有資源，經(jīng)轉(zhuǎn)化E.coliDH5α菌株擴(kuò)增后，用DNA/RNA定量?jī)x測(cè)定DNA濃度，置-20℃冰箱保存。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) MCF7、MDA-MB-231、T47D、MDA-MB-435、MCF10A、293T細(xì)胞系為本實(shí)驗(yàn)室保存。MCF10A細(xì)胞用DMEM/F12培養(yǎng)基（含5%馬血清、100 μg/L霍亂毒素、10 mg/L胰島素、20 μg/L表皮生長(zhǎng)因子、1.4×106mol/L氫化可的松、1%青鏈霉素），其余細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%青鏈霉素）在37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 RT-PCR檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞及正常乳腺上皮細(xì)胞中RIP3 mRNA的表達(dá) 分別收集乳腺癌細(xì)胞株MCF7、MDA-MB-231、T47D、MDA-MB-435及正常乳腺上皮細(xì)胞MCF 10A各約1×106個(gè)，按Trizol和反轉(zhuǎn)錄酶試劑說明書分別提取RNA，用分光光度計(jì)測(cè)定濃度之后，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA，以GAPDH作為內(nèi)參照，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：RIP3上游5＇-GAGTTGCCAACCGAACCATCACT-3＇，下游5＇-TACCGTG?GAGACAGCATTCA-3＇。PCR反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃3 min，變性95℃10 s，退火65.5℃30 s，延伸72℃30 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃5 min后，溫度降至4℃。擴(kuò)增長(zhǎng)度為243 bp。反應(yīng)產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，UVP掃描并分析結(jié)果。

1.4 RIP3全長(zhǎng)編碼序列PCR擴(kuò)增 以逆轉(zhuǎn)錄得到的MCF10A cDNA為模板進(jìn)行RIP3基因cDNA全長(zhǎng)的PCR擴(kuò)增，上游引物：5＇-TGTACAAGTCTAGAGCTAGCATGTCGTGC?GTCAAGTTA-3＇，下游引物：5＇-CGCGGCCGCGGATCCT?TATTTCCCGCTATGATT-3＇，包含NheⅠ、NotⅠ酶切位點(diǎn)。PCR反應(yīng)體系為50 μL，含模板50 ng，10×Phusion緩沖液5 μL，dNTPs每種200 μmol/L，引物0.5 μmol/L和Phusion DNA聚合酶0.5 μL。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性98℃30 s，變性98 ℃ 10 s，退火62 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，20個(gè)循環(huán)，72 ℃10 min后，溫度降至4℃。擴(kuò)增長(zhǎng)度為1 587 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠回收試劑盒回收擴(kuò)增片段。

1.5 mCherry-RIP3表達(dá)載體的構(gòu)建 將上述擴(kuò)增回收產(chǎn)物即目的基因與事先用NheⅠ、NotⅠ酶切的pCDH-mCherry載體連接，反應(yīng)體系：載體1 μL，PCR回收產(chǎn)物3 μL，In-fusion連接酶2.5～3 μL，加入H2O共15 μL，室溫連接30 min后，將連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，經(jīng)氨芐霉素篩選，挑取單個(gè)克隆培養(yǎng)后,取菌液用小提試劑盒提取質(zhì)粒，NheⅠ、NotⅠ酶切鑒定。鑒定產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳并在凝膠成像分析儀上成像。鑒定正確的重組載體送基因公司測(cè)序，經(jīng)測(cè)序比對(duì)正確后，再大量擴(kuò)增。

1.6 包被慢病毒建立穩(wěn)定表達(dá)mCherry-RIP3的MCF7細(xì)胞株 轉(zhuǎn)染前1 d鋪種293T細(xì)胞于6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，使細(xì)胞匯合度達(dá)到50%。取20 μg構(gòu)建的mCherry-RIP3表達(dá)載體，兩種包裝載體各10 μg，鈣法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。同時(shí)轉(zhuǎn)染不含目的基因的熒光載體作為對(duì)照。培養(yǎng)48 h后離心收集上清，-80℃貯存。感染前1 d鋪種MCF7細(xì)胞于6孔板中，每孔2×105個(gè)細(xì)胞。感染時(shí)，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，加入600 μL病毒液及1 μL的聚凝胺，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，觀察熒光，重懸細(xì)胞并加入4 mg/L的殺稻瘟菌素藥篩，維持藥物濃度1周，分別可得到穩(wěn)定表達(dá)RIP3的細(xì)胞株及空白熒光載體的細(xì)胞株。

1.7 Western Blot 將MCF7細(xì)胞、構(gòu)建的表達(dá)mCherry-RIP3及空載體的MCF7細(xì)胞鋪種于6孔板中，培養(yǎng)至匯合度為60%～80%后，每孔加入200 μL細(xì)胞裂解液（Lysis Buffer）裂解MCF7細(xì)胞，收集蛋白。各樣品取30 μg蛋白上樣電泳，轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜（Nitrocellulose Blotting Membranes，NC）過夜。第2天將NC膜轉(zhuǎn)移至封閉液（5%脫脂奶粉）中，搖床封閉1 h，孵育Anti-RIP3兔源的單克隆一抗1 h，TBS-T沖洗，孵育熒光標(biāo)記的二抗1 h，TBS-T沖洗，紅外雙色熒光掃描成像儀，觀察結(jié)果。

1.8 TNF-α及Caspase抑制劑Z-VAD-FMK處理下MCF7的死亡情況 將表達(dá)mCherry-RIP3及空載體的MCF7細(xì)胞(細(xì)胞數(shù)3×105個(gè)/孔)分別鋪于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板（每種細(xì)胞各3個(gè)孔）過夜，分別給予 0 mg/L、50 mg/L TNF-α及20 μmol/L Z-VAD-FMK預(yù)處理30 min，再加入TNF-α至終濃度50 mg/L處理12 h后，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，每種處理隨機(jī)取3個(gè)視野計(jì)算細(xì)胞死亡數(shù)及細(xì)胞總數(shù)。之后在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入Hoechst 33342染料染色10 min，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核的形態(tài)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)以±s表示，各組間比較采用t檢驗(yàn)，每組內(nèi)不同處理方式比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌細(xì)胞系RIP3 mRNA的表達(dá) RIP3 mRNA在MCF10A中表達(dá)較高，而在4種乳腺癌細(xì)胞系中普遍低表達(dá)，其中MDA-MB-435和MDA-MB-231細(xì)胞相對(duì)較高，T47D和MCF7細(xì)胞的表達(dá)量相對(duì)較低，見圖1。本實(shí)驗(yàn)選擇MCF7細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染RIP3重組質(zhì)粒的研究。

Figure 1 Different mRNA levels of RIP3 in 4 kinds of breast cancer cells and 1 kind of mammary epithelial cell MCF10A圖1 RIP3 mRNA在4種不同乳腺癌細(xì)胞及正常乳腺上皮細(xì)胞MCF10A內(nèi)的表達(dá)

2.2 RIP3基因全長(zhǎng)的PCR擴(kuò)增及載體的酶切 以cDNA為模板，PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物約1 587 bp，與預(yù)期大小一致。同時(shí)用限制性內(nèi)切酶NheⅠ、NotⅠ酶切pCDH-mCherry載體，見圖2。

Figure 2 PCR amplification product of RIP3 cDNA and restriction enzyme digestion of the recombinant plasmid mCherry-RIP3圖2 RIP3基因全長(zhǎng)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及重組載體的雙酶切鑒定

2.3 RIP3重組載體的鑒定及其序列的測(cè)定 將RIP3重組載體用NheⅠ、NotⅠ酶切，可見切出大小約1 560 bp的條帶，見圖2。測(cè)序結(jié)果經(jīng)Pubmed Blast比對(duì)后證實(shí)插入pCDH-mCherry載體的目的基因正確無誤。

2.4 mCherry-RIP3融合蛋白在MCF7細(xì)胞中的表達(dá) 將mCherry-RIP3基因通過慢病毒導(dǎo)入MCF7細(xì)胞中，經(jīng)Western blot檢測(cè)到了mCherry-RIP3融合蛋白的表達(dá)，分子質(zhì)量約為85 ku，見圖3A。

2.5 mCherry-RIP3融合蛋白在細(xì)胞中的定位 通過熒光顯微鏡觀察到表達(dá)mCherry-RIP3的MCF7只有細(xì)胞質(zhì)中可見紅色熒光分布，見圖3B。

2.6 mCherry-RIP3融合蛋白在MCF7細(xì)胞中介導(dǎo)TNF-α誘導(dǎo)的程序性壞死 表達(dá)mCherry-RIP3及空載體的MCF7細(xì)胞經(jīng)TNF-α處理均有約50%的細(xì)胞表現(xiàn)出凋亡的形態(tài)特征：細(xì)胞縮小變圓，胞膜清晰完整，核固縮。而Z-VAD-FMK預(yù)處理后再用TNF-α處理，轉(zhuǎn)入空載體的MCF7細(xì)胞的凋亡被抑制，而表達(dá)mCherry-RIP3的MCF7細(xì)胞死亡數(shù)目增加且表現(xiàn)出明顯的壞死樣形態(tài)特征：形態(tài)不規(guī)則，胞膜模糊，核碎裂溶解，見圖4。不同處理方法的空載體-MCF7細(xì)胞和RIP3-MCF7細(xì)胞的存活率均不相同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。未處理及TNF-α處理下的空載體-MCF7與RIP3-MCF7細(xì)胞的存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在TNF-α聯(lián)合Z-VADFMK處理下，RIP3-MCF7細(xì)胞的存活率明顯低于空載體-MCF7的細(xì)胞存活率（P＜0.01），見表1。

Table 1 The cell survival rate of RIP3/Vector-MCF7 under the treatment of TNF-α and Z-VAD-FMK表1 TNF-α及Z-VAD-FMK處理下RIP3/空載體-MCF7細(xì)胞的存活率 （n=3，%）

3 討論

近年來，程序性壞死成為繼凋亡之后細(xì)胞死亡方式的又一研究熱點(diǎn)。傳統(tǒng)理論認(rèn)為，壞死是一種細(xì)胞在受到一些物理因素、化學(xué)因素或生物因素等環(huán)境因素的傷害時(shí)出現(xiàn)的大量急速死亡，是一種被動(dòng)的死亡[3]。后來人們發(fā)現(xiàn)TNF-α不但能誘導(dǎo)多種細(xì)胞的凋亡，而且還能誘導(dǎo)小鼠成纖維細(xì)胞L929的壞死[4]，并且Caspase抑制劑Z-VAD-FMK能加強(qiáng)TNF-α誘導(dǎo)的L929細(xì)胞壞死[5]。這表明這種細(xì)胞壞死可以由特定因子啟動(dòng),按照一定通路和程序發(fā)生，并且是可控的，因而稱為程序性壞死[6]。韓家淮教授課題組研究發(fā)現(xiàn)，在低表達(dá)RIP3的NIH3T3細(xì)胞中，TNF-α誘導(dǎo)的凋亡可以被caspase的廣泛抑制劑ZVAD-FMK.fmk所抑制；而在高表達(dá)RIP3的NIH3T3細(xì)胞,Z-VAD-FMK.fmk卻可以增強(qiáng)TNF-α誘導(dǎo)的死亡，并且死亡呈現(xiàn)壞死的形態(tài)，進(jìn)而證明了RIP3是TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和壞死相互轉(zhuǎn)換的分子開關(guān)[7]。異位表達(dá)RIP3使得對(duì)TNF-α誘導(dǎo)性細(xì)胞壞死有抗性的細(xì)胞轉(zhuǎn)變成敏感型細(xì)胞[2]。Sakon等[8]證明TNF-α誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧簇（ROS）積聚介導(dǎo)了小鼠胚胎成纖維（MEF）細(xì)胞的壞死性死亡。對(duì)其具體的執(zhí)行機(jī)制研究表明，RIP3活化后,通過激活糖原磷酸化酶（glycogen phosphory lase，PYGL）、谷氨酸氨基連接酶（glutamate amino ligase，GLUL）和谷氨酸脫氫酶1（glutamate dehydrogenase 1，GLUD1）產(chǎn)生ROS積聚導(dǎo)致細(xì)胞壞死[9]。

更深入的研究RIP3基因的功能及其下游的相互作用因子將有助于人們發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)。基因功能的研究需借助轉(zhuǎn)基因技術(shù)，本實(shí)驗(yàn)通過從cDNA中PCR擴(kuò)增出RIP3基因全長(zhǎng)，連接至含有紅色熒光蛋白mCherry的真核表達(dá)慢病毒載體中，聯(lián)合利用酶切鑒定以及基因測(cè)序分析的方法，證實(shí)了mCher?ry-RIP3重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。用慢病毒感染本身低表達(dá)RIP3的MCF7細(xì)胞，構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株；用West?ern技術(shù)證明其高效表達(dá)mCherry-RIP3；在熒光顯微鏡下觀察其轉(zhuǎn)染效率及融合蛋白的細(xì)胞定位[10]，并通過TNF-α和Z-VAD-FMK的處理證明了其在MCF7細(xì)胞中介導(dǎo)壞死的作用。

程序性壞死參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，如腦缺血和糖尿病等代謝疾病，神經(jīng)退行性疾病,腫瘤等[11-12]。程序性壞死在腫瘤細(xì)胞中作為一種凋亡的替代死亡方式，其功能缺陷或相關(guān)基因突變可能參與某些腫瘤的發(fā)生發(fā)展[13]。有研究表明程序性壞死不但可以加速腫瘤細(xì)胞的死亡還可能增加腫瘤細(xì)胞對(duì)抗癌藥物的敏感性[14-15]。本研究通過構(gòu)建mCherry-RIP3融合蛋白真核表達(dá)載體，建立穩(wěn)定高表達(dá)RIP3的細(xì)胞系，可以實(shí)時(shí)觀察RIP3的功能定位及其對(duì)細(xì)胞在不同刺激下凋亡、壞死等死亡機(jī)制的影響，以及RIP3調(diào)節(jié)的下游靶基因的啟動(dòng)子、mRNA及蛋白水平的表達(dá)，便于進(jìn)一步研究其在程序性壞死信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中所擔(dān)當(dāng)?shù)慕巧?，從而更有效地調(diào)控細(xì)胞的死亡。為缺血再灌注損傷，神經(jīng)退行性變，腫瘤的治療提供新的靶點(diǎn)[16-17]。

Figure 3 Western blotting of mCherry-RIP3 fusion protein using anti-RIP3 antibody(A)and cellular localization(B)圖3 mCherry-RIP3融合蛋白的Western blot鑒定（A）與細(xì)胞定位（B）

Figure 4 The increased sensitivity of mCherry-RIP3 transfected MCF7 cells to TNF-α and Z-VAD-FMK induced cell necrosis圖4 mCherry-RIP3轉(zhuǎn)染后增強(qiáng)MCF7細(xì)胞對(duì)TNF-α聯(lián)合Z-VAD-FMK誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死的敏感性

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