胡小平 張偉 陳辦成 陳史宏 王勇強 于波

過氧化物酶增殖物激活受體β/δ在銀屑病角質(zhì)形成細胞中的表達

胡小平 張偉 陳辦成 陳史宏 王勇強 于波

目的探討過氧化物酶增殖物激活受體β/δ(PPARβ/δ)在銀屑病患者表皮角質(zhì)形成細胞(KC)中的表達和調(diào)節(jié)因素。方法免疫組化方法檢測PPARβ/δ在銀屑病患者皮損及非皮損表皮中的表達。分離、培養(yǎng)銀屑病患者非皮損區(qū)和皮損區(qū)的KC,以RT-PCR和Western印跡法分別檢測銀屑病患者皮損區(qū)和非皮損區(qū)KC中PPARβ/δ mRNA和蛋白質(zhì)的表達水平。利用PPARβ/δ外源性激動劑GW501516及Ca2+刺激銀屑病非皮損區(qū)KC,觀察其對PPARβ/δ表達的調(diào)節(jié)影響。結(jié)果免疫組化顯示,銀屑病皮損區(qū)PPARβ/δ的表達強度顯著高于正常對照組(t=19.28,P＜0.01)和非皮損區(qū)(t=23.26,P＜0.01)。銀屑病皮損區(qū)PPARβ/δ mRNA和蛋白質(zhì)的表達水平均高于正常對照組(P＜0.01)和非皮損區(qū)(P＜0.01)。10 ng/ml GW501516最大效能促進PPARβ/δ的表達(P＜0.01);1.0 mmol/L Ca2+對KC中PPARβ/δ的表達促進效應(yīng)最明顯(P＜0.01)。結(jié)論PPARβ/δ在銀屑病患者皮損區(qū)表達顯著升高,GW501516和Ca2+能夠促進角質(zhì)形成細胞PPARβ/δ表達水平。

銀屑病;角蛋白細胞;過氧化物酶體增生物激活受體β/δ

過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors，PPAR)是一類激素核受體超家族成員?，F(xiàn)已證實有3種不同的PPAR亞型:PPARα、PPARβ/δ、PPARγ。人皮膚角質(zhì)形成細胞(KC)中,PPARβ/δ是主要的亞型。研究發(fā)現(xiàn), PPARβ/δ能夠刺激KC增殖并阻止凋亡[1],而尋常性銀屑病的炎癥增殖性斑塊是其主要臨床特點,提示PPARβ/δ表達異?？赡芎蛯こＰ糟y屑病發(fā)病有一定的關(guān)系。我們通過研究銀屑病皮損KC中PPARβ/δ mRNA和蛋白水平的表達變化和影響因素,分析PPARβ/δ在銀屑病發(fā)病中的意義。

對象與方法

一、對象

2012年1-11月,在我院皮膚科門診就診的經(jīng)病理確診的進行期尋常性銀屑病患者20例(20～ 56歲),其中男11例,女9例。每例患者均取皮損及皮損旁3 cm內(nèi)非皮損組織各一塊。15例(19～58歲)正常人皮膚來自我院皮膚科和整形外科,其中男8例,女7例。所有標(biāo)本分為2部分,一部分4%甲醛固定、石蠟包埋行免疫組化染色,另一部分保存在0.5%分散酶中4℃過夜。所有對象均排除糖尿病、高血脂、冠心病等內(nèi)科疾病。本實驗經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準,患者均簽署知情同意書。

二、方法

1.引物設(shè)計和合成:用DNAStar軟件設(shè)計引物,PPARβ/δ上游引物為5′-GAGCAGCCA CAGGA GGAAGCC-3′;下游引物為5′-CCGTCACAGCCCAT CTGCAGT-3′,擴增片段長度200 bp。內(nèi)對照GAPDH上游引物:5′-TGAAGGTCGGAGTCAACGG-3;下游引物:5′-TGGAAGATGGTGATGGGAT-3,擴增片段長度為223 bp。所有引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

2.試劑和材料:無血清KC培養(yǎng)基(KSFM), 0.5%分離酶(美國Gibco公司),胎牛血清、0.25%胰酶/EDTA(美國Peprotech公司);GW501516試劑(上海浩天然生物技術(shù)有限公司)。即用型免疫組化超敏SP試劑盒(兔)和DAB顯色試劑盒,TaqDNA聚合酶和標(biāo)準參照物均購于深圳晶美生物工程有限公司。RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,Trizol和PPARβ/δ抗體購于美國Promega和Gibco BRL公司。

3.免疫組化染色:檢測PPARβ/δ在正常表皮、銀屑病皮損和非皮損中的表達。SP法按照說明書進行。一抗為山羊抗人PPARβ/δ單克隆抗體(1∶100稀釋),4℃過夜。二抗為生物素化兔抗羊IgG,37℃孵育30 min,PBS沖洗2 min×3。滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素,37℃孵育15 min,PBS沖洗5 min×4。DAB(20倍稀釋)顯色6 min,蘇木素復(fù)染細胞核,雙蒸水沖洗,常規(guī)脫水、透明,封片。PBS代替一抗作為空白對照。胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒判為陽性細胞。應(yīng)用多功能真彩色病理圖像分析系統(tǒng)對表皮中PPARβ/δ的表達進行半定量檢測。

4.表皮KC的分離和培養(yǎng):手術(shù)后保存在0.5%分散酶中的正常人、銀屑病非皮損區(qū)和皮損區(qū)皮膚標(biāo)本在4℃過夜后,無菌操作臺中分離表皮和真皮。將分離的表皮采用胰酶消化法,37℃,5%CO2培養(yǎng)、傳代,所有的實驗均利用2～3代對數(shù)生長期的KC。不同濃度PPARβ/δ外源性激動劑GW501516 (0、1、5、10、25、50、100 ng/ml)和不同濃度的CaCl2(0、0.5、1.0、2.0、3.0 mmol/L)分別與銀屑病非皮損區(qū)KC共同培養(yǎng)(n=12,方法同上)。

5.RT-PCR:25 μl PCR擴增反應(yīng)體系中包括10 mmol各對上下游引物、200 mmo1/L dNTP混合液、2.5 mmol/L MgCl2,pH 8.3 l0 mmol/LTris-HCI, 50 mmol/L KCl,2U Taq酶、1 μl cDNA,DEPC水補足25 μl。反應(yīng)程序為:96℃3 min,1個循環(huán);96℃1 min 10 s,57℃1 min 10 s,72℃1 min 20 s。35個循環(huán);72℃7 min。以GAPDH為內(nèi)參照?？瞻讓φ諡闊o逆轉(zhuǎn)錄酶的逆轉(zhuǎn)錄樣本,以排外可能來源于污染的基因組DNA的擴增。退火溫度為55℃。反應(yīng)產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中電泳后觀察并拍照。

6.Western印跡:把培養(yǎng)瓶置于冰上,加入冰冷300 μl裂解液,于冰上裂解30 min,4℃下13 500×g離心10 min后取上清20ul用于蛋白質(zhì)定量制備蛋白樣品;根據(jù)標(biāo)準曲線計算出蛋白濃度;將定量好的蛋白質(zhì)按40 μg量上樣SDS-PAGE電泳。4℃層析柜中進行轉(zhuǎn)膜,250 mA 2 h。將一抗用封閉液稀釋至適當(dāng)濃度,放入PVDF膜,室溫下孵育1～2 h后,移至肥皂盒中于室溫下用PBST在搖床上洗3次,每次10 min。同上方法準備二抗稀釋液(1∶3 000)并與膜接觸。ECL反應(yīng)及曝光、顯影。

7.圖像分析和數(shù)據(jù)處理:采用Image ProPlus 6.0圖像分析軟件測定各條帶A值,基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達水平的半定量采用目標(biāo)基因條帶A值與對應(yīng)的GAPDH基因條帶A值的比值計算,數(shù)據(jù)的表達為±s。統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行。均數(shù)的比較采用t檢驗。P＜0.05被認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、PPARβ/δ的免疫組化染色結(jié)果

銀屑病皮損區(qū)陽性細胞主要位于基底層上部細胞;正常對照組及非皮損區(qū)陽性細胞散在表達于全層角質(zhì)形成細胞,主要為細胞核著色,呈棕黃色。銀屑病皮損區(qū)PPARβ/δ(0.636±0.031)的表達強度顯著高于正常對照組(0.364±0.052)和非皮損區(qū)(0.363±0.041),t值分別為19.28、23.26,均P＜0.01;正常對照組和非皮損區(qū)表達強度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.073,P＞0.05)。見圖1。

二、正常人和銀屑病皮損PPARβ/δ mRNA和蛋白的表達

圖1 PPARβ/δ的免疫組化染色結(jié)果(SP×400) 1a:正常表皮棕色顆粒散在表達于角質(zhì)形成細胞核;1b:銀屑病非皮損區(qū)棕色顆粒散在表達于角質(zhì)形成細胞核;1c:銀屑病皮損區(qū)棕色顆粒主要表達在棘層和顆粒層角質(zhì)形成細胞核

PPARβ/δmRNA的表達:所有樣本均有表達,銀屑病皮損區(qū)表皮KC中,PPARβ/δmRNA表達量最高。在皮損區(qū)為0.342±0.032,非皮損區(qū)為0.205± 0.024,正常人表皮為0.195±0.026。皮損區(qū)與非皮損區(qū)(t=15.16,P＜0.01),皮損區(qū)與正常人表皮之間(t=14.4,P＜0.01)表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義;非皮損與正常人皮膚之間表達,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t= 1.125,P＞0.05)。見圖2。

圖2 2a:PPARβ/δmRNA逆轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物電泳圖 1:正常人表皮;2:非皮損;3,4:皮損;5:空白對照。GAPDH/223 bp為內(nèi)參照。2b:正常人和銀屑病皮損PPARβ/δ蛋白的表達 1:正常人表皮;2:非皮損;3,4:皮損。GAPDH/36 000為內(nèi)參照

PPARβ/δ蛋白的表達:PPARβ/δ蛋白和mRNA表達量相符。

三、不同濃度GW501516(0,1,5,10,25,50, 100 ng/ml)和Ca2+(0,0.5,1.0,2.0,3.0 mmol/L)分別與12例銀屑病非皮損區(qū)KC共同培養(yǎng)后,PPARβ/δmRNA和蛋白質(zhì)的表達量

PPARβ/δmRNA的表達:GW501516在10 ng/ml濃度時最大效能促進PPARβ/δmRNA的表達,趨勢類似拋物線,濃度在100 ng/ml時表達量回到基線水平(P＞0.05)。Ca2+濃度在1.0 mmol/L時,PPARβ/ δmRNA表達最明顯,濃度在3.0 mmol/L時表達量回到基線水平(P＞0.05)。

PPARβ/δ蛋白表達:PPARβ/δ蛋白和mRNA表達量相符。見表1,2。

表1 不同濃度GW501516對銀屑病非皮損區(qū)角質(zhì)形成細胞PPARβ/δmRNA和蛋白的表達(±s)

表1 不同濃度GW501516對銀屑病非皮損區(qū)角質(zhì)形成細胞PPARβ/δmRNA和蛋白的表達(±s)

注:n=12。a:與基線相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義P＜0.01

濃度(ng/ml) mRNA表達量 t值 蛋白表達量 t值0 0.240±0.029 0.305±0.029 1 0.230±0.036 0.735 0.300±0.031 0.400 5 0.334±0.028 7.999a 0.393±0.299 7.225a 10 0.433±0.030 15.840a 0.535±0.035 17.140a 25 0.335±0.026 8.298a 0.394±0.028 7.445a 50 0.243±0.041 0.227 0.311±0.046 0.370 100 0.232±0.030 0.612 0.292±0.030 1.085

表2 不同濃度Ca2+對銀屑病非皮損區(qū)角質(zhì)形成細胞PPARβ/δmRNA和蛋白的表達(±s)

表2 不同濃度Ca2+對銀屑病非皮損區(qū)角質(zhì)形成細胞PPARβ/δmRNA和蛋白的表達(±s)

注:n=12。a:與基線相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義P＜0.01

Ca2+濃度(mmol/L) mRNA表達量 t值 蛋白表達量 t值0 0.257±0.020 0.415±0.029 0.5 0.310±0.026 5.455a 0.503±0.029 7.225a 1.0 0.361±0.023 11.740a 0.644±0.034 17.460a 2.0 0.301±0.030 4.172a 0.504±0.028 7.445a 3.0 0.256±0.023 0.094 0.402±0.030 1.085

討論

研究表明,PPAR在皮膚自穩(wěn)態(tài)的維持方面起調(diào)節(jié)作用,具有促進細胞分化、調(diào)節(jié)細胞增殖、抗炎及免疫調(diào)節(jié)等作用[2]。作為PPAR在表皮中最主要的亞型,PPARβ/δ對調(diào)節(jié)KC增殖,表皮對炎癥的反應(yīng)具有重要作用[1]。近年來,越來越多的研究支持PPARβ/δ和銀屑病發(fā)病的關(guān)系,小鼠體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)PPARβ/δ活化能夠觸發(fā)銀屑病特征性的免疫反應(yīng),引起銀屑病樣皮膚損害[3]。由于發(fā)現(xiàn)PPARβ/δ促進了細胞增殖和阻礙了銀屑病皮損中T細胞的凋亡[4],因此還認為PPARβ/δ是銀屑病發(fā)病機制中不正常的免疫和炎癥反應(yīng)之間的聯(lián)系紐帶[5]。我們的研究結(jié)果顯示,正常表皮角質(zhì)形成細胞PPARβ/δ的mRNA和蛋白的基礎(chǔ)表達水平均較顯著,而在銀屑病皮損中表達水平較正常更高。

關(guān)于PPARβ/δ在銀屑病中的表達水平,研究結(jié)果尚不統(tǒng)一。龐曉文等[6]免疫組化的研究結(jié)果顯示,在銀屑病皮損中PPARβ/δ表達是下降的。國外學(xué)者報道在銀屑病皮損中PPARβ/δ表達明顯升高[7-8]。我們通過免疫組化、mRNA和蛋白表達水平證實,進行期銀屑病皮損中PPARβ/δ表達明顯上調(diào),和國外學(xué)者的研究結(jié)果較一致。我們的研究結(jié)果和龐曉文等[6]報道存在不一致,可能原因是患者選擇不同。我們所選取的均為進行期銀屑病患者皮損,而龐曉文等[6]的研究中進行期和穩(wěn)定期患者各占一半,推測銀屑病不同時期的皮損和非皮損中PPARβ/δ的表達量有不同,但本研究和龐曉文等的研究均未作分組比較且病例數(shù)較少,目前尚不能得出肯定結(jié)論。

在已發(fā)表的研究中,PPARβ/δ對表皮的增殖作用存在爭議,一些研究認為,PPARβ/δ的激活促進了表皮細胞的增殖[9],而另一些研究認為其活化后會抑制表皮細胞增殖[10-11]。對于這些研究現(xiàn)象的爭議,目前的解釋認為:細胞中PPARβ/δ活化可能存在雙相反應(yīng),這種反應(yīng)主要依賴于炎癥信號所誘發(fā)的變量情況,即在炎癥刺激作用下,PPARβ/δ表現(xiàn)為促進細胞增殖作用,而在非炎癥情況下表現(xiàn)為抑制細胞增殖功能。我們的免疫組化結(jié)果顯示,非皮損區(qū)和正常表皮PPARβ/δ散在表達于全層角質(zhì)形成細胞核,而在皮損區(qū)主要表達在基底細胞層以上,推測正常情況下PPARβ/δ對KC增殖或分化作用僅限于基底層,分布比較穩(wěn)定,而在炎癥刺激情況下,PPARβ/δ表達升高可能促進了表皮各層KC的增殖,并影響了其正常分化,參與了銀屑病皮損的病理形成過程。

本研究應(yīng)用不同濃度的GW501516和銀屑病非皮損區(qū)KC共同培養(yǎng),檢測發(fā)現(xiàn)GW501516在一定濃度范圍內(nèi)能促進PPARβ/δ表達,10 ng/ml時達到最大效能,此后回到基線水平。提示外源性PPARβ/δ激動劑在一定濃度范圍內(nèi)能夠促進其表達,推測內(nèi)源性PPARβ/δ激動劑同樣能夠促進其表達。體外研究發(fā)現(xiàn),Ca2+參與表皮KC的增殖[12]。我們應(yīng)用不同濃度的鈣離子和銀屑病非皮損區(qū)KC共同培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)Ca2+在一定濃度范圍內(nèi)能促進PPARβ/δ表達,1.0 mmol/L Ca2+時效應(yīng)最明顯。提示外源性Ca2+能夠促進其表達,但是鈣離子是否直接影響了PPARβ/δ的表達,還是通過其他途徑如通過內(nèi)源性PPARβ/δ激動劑促進其表達,進一步的研究將會提供有價值的線索。我們的研究顯示,GW501516和Ca2+均在中間濃度時能夠最大效能促進 KC的PPARβ/δ表達,表達趨勢類似一拋物線。分析其可能原因為受體結(jié)合區(qū)域可能在一定濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)出飽和性,激活的PPARβ/δ和維A酸受體形成二聚體后才能發(fā)揮作用,推測高濃度GW501516和Ca2+,可能會抑制與受體的結(jié)合,從而影響了PPARβ/δ表達水平。

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2014-01-09)

(本文編輯:吳曉初)

Expression of peroxisome proliferator-activated receptor β/δ in psoriatic epidermal keratinocytes

Hu Xiaoping，Zhang Wei，Chen Bancheng，Chen Shihong，Wang Yongqiang，Yu Bo.Department of Dermatology，Peking University Shenzhen Hospital，Guangdong 518036，China

Yu Bo，Email:yubomd@163.com

ObjectiveTo measure the expression of peroxisome proliferator-activated receptor β/δ(PPARβ/ δ)in epidermal keratinocytes from patients with psoriasis，and to investigate its regulatory factors.MethodsTissue specimens were obtained from both lesional and non-lesional skin of 20 patients with psoriasis as well as from normal skin of 15 human controls.An immunohistochemical method was used to examine the expression of PPARβ/δ in these tissue specimens.Epidermal keratinocytes were isolated from these tissue specimens and subjected to a primary culture.After several passages of subculture，non-lesional psoriatic keratinocytes were stimulated with different concentrations of GW501516(an agonist of PPARβ/δ，0-100 ng/ml)and Ca2+(0-3.0 mmol/L).Reverse transcription-PCR and Western blot were performed to measure the mRNA and protein expressions of PPARβ/δ in the primary keratinocytes and stimulated keratinocytes respectively.ResultsImmunohistochemistry showed that the expression intensity of PPARβ/δ was significantly higher in lesional psoriatic skin than in normal control skin(t= 19.28，P＜0.01)and non-lesional psoriatic skin(t=23.26，P＜0.01).Increased mRNA and protein levels of PPARβ/δ were observed in lesional psoriatic keratinocytes as compared to normal control keratinocytes(bothP＜0.01)and non-lesional psoriatic keratinocytes(bothP＜0.01).Among these stimulated non-lesional psoriatic keratinocytes，those treated with GW501516 at 10 ng/ml and those with Ca2+of 1.0 mmol/L showed the strongest expression of PPARβ/δ(bothP＜0.01).ConclusionsThe expression of PPARβ/δ，which is higher in lesional psoriatic skin，can be enhanced by GW501516 and Ca2+in keratinocytes.

Psoriasis;Keratinocytes;PPARβ/δ

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.10.011

廣東省自然科學(xué)基金(S2012040006694);廣東省醫(yī)學(xué)科研基金(B2012329);深圳市科技計劃項目(201203035)

518036深圳,北京大學(xué)深圳醫(yī)院皮膚科

于波,Email:yubomd@163.com