張洪英 王小艷 陳星宇 逄明杰 史同新

白芍總苷對(duì)HaCaT細(xì)胞表達(dá)白細(xì)胞介素18的影響及相關(guān)信號(hào)通路的研究

張洪英 王小艷 陳星宇 逄明杰 史同新

目的觀察白芍總苷(TGP)對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞(KC)表達(dá)白細(xì)胞介素(IL)-18的影響,并初步探討ERK1/2、JNK1/2信號(hào)通路在其中的作用。方法將部分HaCaT細(xì)胞分為3個(gè)組,即對(duì)照組加入0.031%二甲基亞砜的細(xì)胞培養(yǎng)液,TGP組分別加入6種不同濃度的TGP(0.5、2.5、12.5、62.5、125.0、312.5 mg/L),抑制劑組分別加入10 μmol/L ERKl/2抑制劑PD98059和JNK1/2抑制劑SP600125預(yù)處理2 h后,再加入125 mg/L TGP。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h。實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR方法和ELISA方法檢測(cè)HaCaT細(xì)胞IL-18的表達(dá)。部分HaCaT細(xì)胞分為兩組,一組用125 mg/L TGP分別處理15,30,60 min,另一組分別用10 μmol/L ERKl/2抑制劑PD98059和JNK1/2抑制劑SP600125預(yù)處理后再加入125 mg/L TGP分別處理15,30,60 min。免疫印跡技術(shù)觀察兩組HaCaT細(xì)胞ERK1/2、JNK1/2磷酸化水平。結(jié)果TGP在低濃度(0.5、2.5 mg/L)時(shí)對(duì)HaCaT細(xì)胞IL-18 mRNA和蛋白的表達(dá)有促進(jìn)作用,62.5～125.0 mg/L時(shí)可抑制IL-18 mRNA和蛋白的表達(dá),125 mg/L TGP抑制作用最強(qiáng)。TGP(125 mg/L)作用15 min后磷酸化ERKl/2蛋白表達(dá)達(dá)到高峰,表達(dá)水平為0.448±0.018,與對(duì)照組(0.204±0.005)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);30 min后表達(dá)水平降低至0.213±0.005,60 min后為0.217±0.005,與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。PD98059預(yù)處理組磷酸化ERK1/2表達(dá)水平為0.237±0.010,與單獨(dú)125 mg/L TGP給藥組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。125 mg/L TGP對(duì)JNK蛋白的磷酸化作用不明顯,各組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論TGP可抑制IL-18 mRNA和蛋白的表達(dá), ERK1/2信號(hào)途徑可能介導(dǎo)這一抑制作用。

白芍;角蛋白細(xì)胞;白細(xì)胞介素18;絲裂原激活蛋白激酶類

我們?cè)谂R床中應(yīng)用白芍總苷膠囊(TGP,商品名帕夫林,寧波立華制藥有限公司生產(chǎn))治療銀屑病取得了較好的療效[1-2],但其作用機(jī)制尚未明確。通過既往實(shí)驗(yàn),我們知道,TGP可通過p38MAPK途徑抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和IL-23的表達(dá),從而參與抑制角質(zhì)形成細(xì)胞(KC)增殖的過程[3]。近來研究發(fā)現(xiàn),IL-18能促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生Thl型免疫反應(yīng),同時(shí)能夠抑制Th2免疫應(yīng)答,在尋常性銀屑病的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用[4]。在正常人皮膚中,KC是IL-18的主要來源[5]。本實(shí)驗(yàn)中,我們檢測(cè)TGP對(duì)體外培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞表達(dá)IL-18的影響,同時(shí)觀察TGP對(duì)ERK1/2、JNK1/2通路中相關(guān)分子磷酸化影響,及ERK/JNK相關(guān)抑制劑預(yù)處理后TGP對(duì)HaCaT細(xì)胞IL-18表達(dá)的影響,從而探討TGP治療銀屑病的作用機(jī)制。

材料與方法

一、材料

TGP由寧波朗生醫(yī)藥有限公司提供。臨用前按1∶1(g/ml)以二甲基亞砜(DMSO)溶解,再用培養(yǎng)液配成所需濃度,過濾除菌分裝。RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液、新生牛血清產(chǎn)自杭州四季青生物公司,抗總細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(T-ERK1/2)、總Jun氨基末端激酶(T-JNK1/2)單克隆抗體產(chǎn)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公 司 ,ERK1/2 抑 制 劑PD98059、JNK1/2阻斷劑SP600125產(chǎn)自美國(guó)Gibco公司,抗磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)、磷酸化JNK 1/2 (p-JNK 1/2)單克隆抗體產(chǎn)自美國(guó)Santa Cruz公司, IL-18 ELISA試劑盒產(chǎn)自深圳晶美生物工程有限公司,SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒產(chǎn)自大連Takara公司,總RNA提取試劑盒產(chǎn)自北京天根生化科技有限公司。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng):HaCaT細(xì)胞由韓國(guó)延世大學(xué)丁擘曉博士惠贈(zèng)。培養(yǎng)基采用含有10%新生牛血清的1640培養(yǎng)基,將HaCaT細(xì)胞按1×105/ml接種于25或50ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-18蛋白含量:細(xì)胞培養(yǎng)于50 ml培養(yǎng)瓶中。①對(duì)照組:含0.031%DMSO的細(xì)胞培養(yǎng)液;②TGP組:參照文獻(xiàn)[3]分別加入6種濃度TGP(0.5、2.5、12.5、62.5、125.0、312.5 mg/L);③抑制劑組:10 μmol/L ERKl/2抑制劑PD98059和JNK l/2抑制劑SP600125分別預(yù)處理2 h后,加入125 mg/L TGP。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液,采用雙抗體夾心ELISA試驗(yàn)檢測(cè)IL-18蛋白含量,按照操作說明書進(jìn)行,結(jié)束后立即上機(jī)測(cè)吸光度A值(450 nm),根據(jù)各個(gè)樣品的A450值,在標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出相應(yīng)的濃度值。

3.反轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR檢測(cè)IL-18 mRNA的表達(dá):檢索基因庫(kù),應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)上、下游引物,IL-18上游引物為5′-GCCTGGACAGTCAGCA AGGA-3′,下游引物5′-TCTACTGGTTCAGCAGCCA TCTTTA-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小342 bp;β肌動(dòng)蛋白上游引物5′-ACACTGTGCCCATCTACG-5′,下游引物5′-TGTCACGCACGATTTCC-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小153 bp,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。實(shí)驗(yàn)分組同上述蛋白檢測(cè)。收集細(xì)胞提取總RNA。將提取的總RNA按試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取cDNA 2 μl,加2.5×RealMasterMix/ SYBR solution 25 μl,上下游引物各1 μl,加DEPC水至反應(yīng)總體積50 μl,進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。IL-18反應(yīng)條件:94℃變性2 min,58℃退火45 s,72℃延伸60 s,共反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后,在ABI Prism SDS 2.0軟件上進(jìn)行自動(dòng)分析,查看每個(gè)基因的擴(kuò)增情況,導(dǎo)出相應(yīng)的域值循環(huán)數(shù)(Ct),校正cDNA模板的細(xì)胞拷貝數(shù),實(shí)時(shí)RT-PCR結(jié)果的計(jì)算采用△Ct值法(△Ct值=樣品Ct均值-內(nèi)參照Ct均值,計(jì)算相對(duì)量采用2-△△Ct),比較不同待測(cè)標(biāo)本DNA的△Ct值與正常標(biāo)本DNA△Ct值的變化,對(duì)未知標(biāo)本靶基因的原始拷貝數(shù)作出判斷。

4.免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè)ERK1/2、JNK1/2:取細(xì)胞懸液以5×104細(xì)胞/孔接種于50 ml培養(yǎng)瓶中。待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%融合狀態(tài)時(shí),進(jìn)行如下處理:①參照文獻(xiàn)[3]用125 mg/L TGP分別刺激細(xì)胞15、30、60 min;②分別以 10 μmol/L ERKl/2抑制劑PD98059、JNK1/2抑制劑SP600125預(yù)處理2 h后,加入125 mg/LTGP刺激15、30、60 min。收集細(xì)胞,檢測(cè)p-ERKl/2、T-ERKl/2、p-JNK1/2、T-JNK1/2。加入封閉液稀釋的一抗(p-ERK1/2 1∶1 000、ERK1/2 1∶200,p-JNK1/2 1∶200,JNK1/2 1∶200),置37℃水浴搖床溫育2 h,含吐溫的乙醇胺緩沖鹽溶液(TBST)洗膜,繼與辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔二抗(1∶400)室溫孵育1 h,ECL顯色系統(tǒng)X光片感光顯影。胞質(zhì)內(nèi)蛋白表達(dá)水平以ERK1/2、JNK1/2與β肌動(dòng)蛋白光密度比值表示,磷酸化ERK1/2、JNK1/2蛋白表達(dá)水平以p-ERK1/2、p-JNK1/2與β肌動(dòng)蛋白光密度比值表示,應(yīng)用Qwin圖像分析軟件進(jìn)行定量分析。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以±s表示,兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、TGP對(duì)HaCaT細(xì)胞表達(dá)和分泌IL-18影響

見表1。0.5、2.5 mg/L TGP作用于HaCaT細(xì)胞48 h,IL-18的分泌量及mRNA的表達(dá)高于對(duì)照組(均P＜0.05);12.5 mg/L TGP作用48 h后HaCaT細(xì)胞IL-18的分泌量及mRNA的表達(dá)與對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05);TGP在62.5、125 mg/L時(shí),IL-18的分泌及mRNA的表達(dá)顯著低于對(duì)照組(均P＜0.05),其中在125 mg/L時(shí)分泌水平最低(P＜0.01)。

經(jīng)ERKl/2抑制劑PD98059預(yù)處理2 h后,再給予125 mg/L TGP作用24 h,HaCaT細(xì)胞IL-18的分泌量及mRNA的表達(dá)較單獨(dú)125 mg/L TGP作用時(shí)明顯增高(均P＜0.01)。經(jīng)JNK l/2拮抗劑SP600125預(yù)處理2 h后,再給予125 mg/L TGP作用24 h,HaCaT細(xì)胞IL-18的分泌量及mRNA的表達(dá)較單獨(dú)125 mg/L TGP作用時(shí),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。

表1 白芍總苷及相關(guān)信號(hào)阻斷劑對(duì)HaCaT細(xì)胞表達(dá)和分泌IL-18的影響(±s)

表1 白芍總苷及相關(guān)信號(hào)阻斷劑對(duì)HaCaT細(xì)胞表達(dá)和分泌IL-18的影響(±s)

注:n=6。與對(duì)照組相比,a:P＜0.05,b:P＜0.01;與125 mg/L白芍總苷組比較,c:P＜0.05

組別 IL-18分泌水平(pg/ml) IL-18 mRNA對(duì)照組 66.33±2.80 0.007±0.000白芍總苷組0.5 mg/L 78.83±1.94a 0.008±0.000a 2.5 mg/L 81.33±3.44a 0.009±0.000a 12.5 mg/L 64.33±1.63 0.007±0.000 62.5 mg/L 52.17±2.79a 0.004±0.000a 125.0 mg/L 37.17±2.93b 0.002±0.000b 312.5 mg/L 64.50±1.87 0.007±0.000 PD98059+白芍總苷組(125 mg/L) 66.33±2.07c 0.007±0.000c SP600125+白芍總苷組(125 mg/L) 35.33±1.97 0.002±0.000

圖1 125 mg/L白芍總苷作用于HaCaT細(xì)胞,磷酸化ERK1/2 (P-ERK1/2)蛋白表達(dá)于15 min達(dá)到最高

二、TGP對(duì)HaCaT細(xì)胞ERK1/2、JNK1/2磷酸化的影響

125 mg/LTGP作用于孵育的HaCaT細(xì)胞后,磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)蛋白表達(dá)于15 min達(dá)到最高,表達(dá)水平為0.448±0.018,與對(duì)照組(0.204± 0.005)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=50.263,P＜0.01),見圖1。30 min后p-ERK1/2表達(dá)水平逐漸降低至0.213±0.005,60 min后p-ERK1/2表達(dá)水平為0.217±0.005,與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。125 mg/L TGP作用于HaCaT細(xì)胞15、30、60 min時(shí)JNK蛋白的磷酸化水平與對(duì)照組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05),見圖2。125 mg/L TGP作用于HaCaT細(xì)胞15、30、60 min時(shí)T-ERK1/2、T-JNK1/2蛋白表達(dá)分別與對(duì)照組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。

圖2 125 mg/L白芍總苷對(duì)HaCaT細(xì)胞JNK1/2蛋白的磷酸化水平影響不明顯

圖3 HaCaT細(xì)胞經(jīng)ERKl/2抑制劑PD98059預(yù)處理2 h后,再給予125 mg/L白芍總苷孵育15 min,p-ERK1/2表達(dá)水平與單獨(dú)125 mg/L相比明顯下降

圖4 HaCaT細(xì)胞經(jīng)JNK1/2抑制劑SP600125預(yù)處理2 h后,再給予125 mg/L白芍總苷孵育15 min,p-JNK1/2表達(dá)水平與單獨(dú)125 mg/L白芍總苷給藥組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

HaCaT細(xì)胞分別經(jīng)ERKl/2抑制劑PD98059預(yù)處理2 h后,再給予125 mg/L TGP孵育15 min,結(jié)果p-ERK1/2表達(dá)水平為0.237±0.010,與單獨(dú)125 mg/L TGP給藥組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=35.598,P＜0.01),見圖3。JNK1/2抑制劑SP600125(10 μmol/L)預(yù)處理2 h后,再給予125 mg/L TGP孵育15 min, p-JNK1/2表達(dá)水平與單獨(dú)125 mg/L TGP給藥組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),見圖4。

討論

MAPK通路是細(xì)胞內(nèi)的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),調(diào)控細(xì)胞的分裂、增殖,主要包括:ERK1/2、JNK和p38。其中,ERK是MAPK家族的經(jīng)典轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一,有ERK1和ERK2兩種亞型,在受到刺激時(shí),通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)誘發(fā)多種癌基因的相繼激活,參與細(xì)胞的增生和分化[6]。JNK是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中MAPK的另一亞類,JNK家族已克隆10個(gè)JNK異構(gòu)體,它們分別由JNK1、JNK2和JNK3基因編碼,其中JNK1和JNK2在各種組織細(xì)胞中廣泛表達(dá)。MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑的異常與銀屑病發(fā)病密切相關(guān)。Haase等[7]認(rèn)為MAPK激酶的活化可以使角質(zhì)形成細(xì)胞增殖率升高致使表皮過度增生,皮炎發(fā)生。Zhang等[8]研究表明與銀屑病患者非皮損區(qū)表皮及正常人表皮相比,銀屑病患者皮損中MAPK活性明顯增高,而非皮損區(qū)表皮與正常人表皮MAPK活性無明顯差異。Takahashi等[9]研究顯示磷酸化的ERK和JNK在銀屑病受累皮膚較非受累皮膚表達(dá)升高。

IL-18是IL-1超家族的成員,在神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)間是一種重要的介質(zhì)[10]。IL-18在皮膚免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。角質(zhì)形成細(xì)胞IL-18表達(dá)異常,與慢性炎癥性皮膚病密切相關(guān),如銀屑病、特應(yīng)性皮炎等。角質(zhì)形成細(xì)胞來源的IL-18參與銀屑病皮損局部的Thl免疫反應(yīng)的發(fā)生,其活性受到皮膚炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié),在炎癥反應(yīng)中具有重要作用[11-13]。研究發(fā)現(xiàn)IL-18在銀屑病皮損表皮基底層上KC中表達(dá)增加,推測(cè)IL-18可能通過誘導(dǎo)IFN-γ在銀屑病的初始炎癥中發(fā)揮作用[14]。

TGP藥理作用廣泛,具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫功能,影響細(xì)胞增殖、止痛、保肝等作用。目前TGP治療銀屑病作用機(jī)制的研究較多集中在Thl/Th2細(xì)胞失衡及其相關(guān)細(xì)胞因子水平的調(diào)節(jié)。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)[3],TGP可抑制VEGF和IL-23的表達(dá),從而參與抑制KC的增殖,p38MAPK途徑可能參與該過程。本研究顯示,TGP可以呈時(shí)間依賴性地促進(jìn)ERK1/2磷酸化,JNK磷酸化不明顯。ERKl/2抑制劑PD98059可以拮抗 TGP對(duì) HaCaT細(xì)胞 IL-18 mRNA和蛋白表達(dá)的抑制作用。從以上結(jié)果我們推測(cè),TGP可以通過ERK1/2途徑,抑制HaCaT細(xì)胞對(duì)IL-18的表達(dá)和分泌,從而減輕銀屑病的炎癥反應(yīng)。角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和表達(dá)炎癥因子的信號(hào)調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng),MAPK、蛋白激酶B(PKB)、核因子kB(NF-kB)、激活蛋白1(AP-1)等信號(hào)分子均參與角質(zhì)形成細(xì)胞調(diào)控過程,MAPK通路與其他的許多通路之間存在廣泛的交互作用,TGP治療銀屑病的更多的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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2014-03-09)

(本文編輯:尚淑賢)

Effect of total glucosides of paeony on the expression of interleukin-18 in human HaCaT keratinocytes and its related signaling pathways

Zhang Hongying*，Wang Xiaoyan，Chen Xingyu，Pang Mingjie，Shi Tongxin.*Department of Dermatology，Qingdao Municipal Hospital，Qingdao 266011，China

Shi Tongxin，Email:shitx2006@163.com

ObjectiveTo evaluate the effect of total glucosides of paeony(TGP)on the expression of interleukin-18(IL-18)in human HaCaT keratinocytes，and to explore the roles of extracelluar signal-regulated protein kinase1/2(ERK1/2)and c-Jun N-terminal kinase 1/2(JNK1/2)signaling pathways in the effect.MethodsSome cultured human HaCaT keratinocytes were classified into three groups:control group treated with dimethyl sulfoxide(0.031%)，TGP groups treated with 6 different concentrations(0.5，2.5，12.5，62.5，125.0 and 312.5 mg/L) of TGP respectively，inhibitor groups treated with TGP of 125 mg/L after 2-hour pretreatment with PD98059(an ERK1/2 inhibitor)and SP600125(a JNK1/2 inhibitor)of 10 μmol/L respectively.After additional culture for 48 hours，reverse transcription(RT)-PCR was performed to measure the mRNA expression level of IL-18，and enzymelinked immunosorbent assay(ELISA)to determine the level of IL-18 protein in the culture supernatant of HaCaT cells.Some HaCaT keratinocytes were classified into two groups to be treated with TGP of 125 mg/L for 15，30 and 60 minutes with or without the pretreatment with PD98059 and SP600125 of 10 μmol/L;then，Western blot was carried out to determine the phosphorylation levels of ERK1/2 and JNK1/2 in HaCaT cells.ResultsThe levels of IL-18 mRNA and protein in culture supernatant were significantly increased by TGP of 0.5 and 2.5 mg/L，but decreased by TGP of 62.5 and 125.0 mg/L，and TGP of 125.0 mg/L showed the strongest inhibitory effect.After treatment with TGP of 125.0 mg/L，the level of phosphorylated ERK1/2 in HaCaT cells peaked at 15 minutes(0.448 ±0.018)，decreased to 0.213±0.005 at 30 minutes and 0.217±0.005 at 60 minutes，with significant differences between TGP-treated and untreated cells at 15 minutes(0.448±0.018 vs.0.204±0.005，P＜0.05)but not at 30 or 60 minutes(bothP＞0.05).The phosphorylation level of ERK1/2 was 0.237±0.010 in HaCaT cells pretreated with PD98059 prior to the treatment with TGP，significantly different from that in HaCaT cells treated with TGP only(P＜0.01).TGP of 125.0 mg/L had no obvious effect on JNK phosphorylation，and there was no significant difference in the level of phosphorylated JNK1/2 between HaCaT cells untreated and those treated with TGP of 125.0 mg/L for different durations(allP＞0.05).ConclusionsTGP can inhibit the expression of IL-18 mRNA and protein in HaCaT cells，likely through the ERK1/2 signaling pathway.

RADIX PAEONIAE ALBA;Keratinocytes;Interleukin-18;Mitogen-activated protein kinases

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.10.012

青島市科技局課題(10-3-3-4-20-nsh)

260011青島市市立醫(yī)院皮膚科(張洪英、王小艷、陳星宇、史同新),耳鼻喉科(逢明杰)

史同新,Email:shitx2006@163.com