黨柱，朱海靜，焦宇，陸濤*

(1.中國(guó)藥科大學(xué)理學(xué)院，江蘇 南京 211198; 2.中國(guó)人民解放軍第二炮兵總醫(yī)院，北京 100088)

由于所處異于陸地生物的獨(dú)特外界環(huán)境，海洋生物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中能代謝產(chǎn)生一些結(jié)構(gòu)獨(dú)特的化學(xué)物質(zhì)——次生代謝產(chǎn)物(secondary metabolites)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，很多海洋生物（如石房蛤、麝香蛸、?？⒑Ｍ玫龋┑拇紊x產(chǎn)物對(duì)人類多種疾病的藥效甚至遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)目前臨床使用的藥物。海綿是一種最低等的多細(xì)胞動(dòng)物，結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單，但作為一個(gè)特殊生物群體，其含有極豐富的生物活性物質(zhì)，其中許多具有抗腫瘤活性。

1988年，猶他大學(xué)Ireland研究小組和康奈爾大學(xué)Clardy研究小組共同發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了一種從海綿中提取分離得到的紅色活性生物堿Fascaplysin(1)。迄今已發(fā)現(xiàn)該化合物具有多種生物活性，包括抗腫瘤、抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒、抗瘧疾、抑制膽堿酯酶等[1-2]。本文對(duì)Fascaplysin的抗腫瘤機(jī)制、全合成及結(jié)構(gòu)改造的研究進(jìn)展作一綜述。

1 Fascaplysin的抗腫瘤機(jī)制

細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)是一類促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程的激酶，在細(xì)胞周期中發(fā)揮重要作用，迄今已發(fā)現(xiàn)其有13種亞型[3-7]。近期，維也納大學(xué)的Hamilton等[8]在小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株抑制實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，CDK抑制劑與喜樹堿衍生物具有協(xié)同作用。CDK4是CDK家族中的一種亞型，在細(xì)胞周期G0-G1期中起關(guān)鍵作用，同時(shí)對(duì)G1/S期也有一定影響，且多項(xiàng)研究表明，抑制CDK4活性，能致使細(xì)胞周期停滯[9-11]。哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Yu等[12]在實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，抑制CDK4激酶，對(duì)人表皮生長(zhǎng)因子受體-2（ErbB-2）過(guò)度表達(dá)的乳腺癌患者具有顯著療效?；菔瞎狙芯咳藛T的一項(xiàng)研究報(bào)告表明，Cyclin D1/ CDK4在MCF-7乳腺癌細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)能促進(jìn)Rb蛋白的磷酸化，并促進(jìn)細(xì)胞周期越過(guò)G1/S期，導(dǎo)致細(xì)胞增殖[13]。另一項(xiàng)研究還發(fā)現(xiàn)，CDK4抑制劑能增強(qiáng)紫杉醇對(duì)肺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性[14]。因此，CDK4被證實(shí)是一個(gè)抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的藥物作用靶點(diǎn)。

諾華公司的一項(xiàng)研究表明，F(xiàn)ascaplysin可選擇性抑制 CDK4/Cyclin D1， 其 IC50達(dá) 0.35 μmol·L-1(Rajeev等 ,Biochem Biophys Res Commun, 2000年)。Nathaniel等（Tetrahedron Lett, 2003年)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)研究顯示，F(xiàn)ascaplysin對(duì)白血病L1210細(xì)胞株的IC50達(dá)0.65 nmol·L-1。H?rmann等 (Bioorg Med Chem, 2001年)則研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ascaplysin分子的平面結(jié)構(gòu)能非特異性地嵌入DNA結(jié)構(gòu)，從而改變DNA分子的構(gòu)象，抑制基因轉(zhuǎn)錄與復(fù)制。此外，F(xiàn)ascaplysin還具有促細(xì)胞凋亡和抑制血管生成作用，可抑制小鼠腫瘤細(xì)胞和人宮頸癌HeLa 細(xì)胞生長(zhǎng)[15-17]。Wang等[18]近期又經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ascaplysin能通過(guò)上調(diào)促凋亡受體TRAILR2 (DR5)的表達(dá)來(lái)激活DR5介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。所以，目前認(rèn)為CDK4是Fascaplysin產(chǎn)生抗腫瘤作用的主要靶標(biāo)。

CDK4的晶體結(jié)構(gòu)已在2009年被確證，但CDK4與Fascaplysin結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)目前還未見報(bào)道。Aubry等[19]用數(shù)學(xué)建模方法建立了Fascaplysin與CDK4結(jié)合模型：Fascaplysin可嵌入CDK4的ATP結(jié)合口袋中，主要通過(guò)氫鍵、庫(kù)侖力、π—π 作用、范德華力等方式與CDK4發(fā)生作用，而其結(jié)構(gòu)中的NH和羰基可分別作為氫鍵供體和受體與CDK4鉸鏈區(qū)Val96形成氫鍵（見圖1）。Fascaplysin與CDK4的結(jié)合動(dòng)力學(xué)計(jì)算結(jié)果證實(shí)，F(xiàn)ascaplysin的芳環(huán)平面中帶正電荷的季氮對(duì)其與CDK4的ATP結(jié)合口袋之間的庫(kù)侖力有重要貢獻(xiàn)，因此這一基團(tuán)對(duì)Fascaplysin的選擇性起至關(guān)重要的作用[20]。

圖1 Fascaplysin與CDK4結(jié)合模型Figure 1 Binding model of Fascaplysin to CDK4

2 Fascaplysin的全合成

自發(fā)現(xiàn)Fascaplysin以來(lái)，人們一直在探索其全合成路線。20世紀(jì)90年代初，Gribble等( J Org Chem,1992年)首次報(bào)道了Fascaplysin的全合成（見圖2），其以吲哚為原料，先通過(guò)草酰氯合成出雙吲哚結(jié)構(gòu)，再經(jīng)過(guò)環(huán)合、氧化，共5步反應(yīng)，得到目標(biāo)產(chǎn)物，總收率為33%。該合成路線較長(zhǎng)，收率低，且反應(yīng)中需用到草酰氯和氫化鈉，對(duì)無(wú)水操作要求較高。

圖2 Gribble等報(bào)道的Fascaplysin全合成路線Figure 2 Total synthesis route of Fascaplysin reported by Gribble et al

隨 后，Rocca等(Tetrahedron Lett,1993年) 報(bào) 道 了Fascaplysin的第2條全合成路線（見圖3），該合成路線突破了使用吲哚的局限，以酰胺取代的苯硼酸和鹵素取代的吡啶為起始原料，經(jīng)4步反應(yīng)，合成目標(biāo)產(chǎn)物，縮短了合成路線，并提高了收率，最終收率達(dá)75%，但原料和試劑較為昂貴，合成成本提高。

圖3 Rocca等報(bào)道的Fascaplysin全合成路線Figure 3 Total synthesis route of Fascaplysin reported by Rocca et al

Molina等(Tetrahedron Lett,1994年) 則采用Wittig反應(yīng)，成功合成了Fascaplysin（見圖4），4步反應(yīng)的最終收率約28%。其中最后一步，通過(guò)Sandmeyer反應(yīng)，合成出季銨鹽結(jié)構(gòu)，同時(shí)將脫保護(hù)基和脫羧反應(yīng)并為一步進(jìn)行，將氨基制成重氮鹽形式。然而，該合成路線雖然較短，但起始原料不易制得，限制了此合成方法的應(yīng)用。

圖4 Molina等報(bào)道的Fascaplysin全合成路線Figure 4 Total synthesis route of Fascaplysin reported by Molina et al

Radchenko等(Tetrahedron Lett,1997年)也報(bào)道了一條新的Fascaplysin全合成路線（見圖5），該路線以色胺和鄰溴苯乙酸為原料，縮合成酰胺后，在三氯氧磷作用下環(huán)合，形成二氫咔啉結(jié)構(gòu)，再以二氧化錳脫氫，同時(shí)將咔啉1位亞甲基氧化成羰基，最后在220 ℃高溫下將化合物熔融，致N原子發(fā)生親核反應(yīng)而環(huán)合，最終收率為44%。該合成方法中的原料易得，但最后一步的溫度較高，在熔融時(shí)原料會(huì)升華和碳化。筆者在進(jìn)行該步反應(yīng)時(shí)，曾嘗試用二苯醚作為溶劑，結(jié)果，此單步反應(yīng)收率從40%提高到94%。

圖5 Radchenko等報(bào)道的Fascaplysin全合成路線Figure 5 Total synthesis route of Fascaplysin reported by Radchenko et al

2010年，Zhidkov等[21]報(bào)道了2條類似的Fascaplysin全合成路線（見圖6），分別通過(guò)3步和4步反應(yīng)得到終產(chǎn)物，收率均為30%。這2條合成路線巧妙地利用Borsche-Drechsel反應(yīng)合成出Fascaplysin的B環(huán)，而最后季銨鹽結(jié)構(gòu)的制備方法與Gribble等首次報(bào)道的合成路線相同。

圖6 Zhidkov等報(bào)道的Fascaplysin全合成路線Figure 6 Total synthesis route of Fascaplysin reported by Zhidkov et al

2012年，Bharate等[22]發(fā)現(xiàn)一條簡(jiǎn)單的Fascaplysin全合成路線（見圖7），即以色胺和鄰氯苯乙二醛為原料，通過(guò)2步反應(yīng)合成目標(biāo)產(chǎn)物，總收率為68%。該合成路線的第1步便將Radchenko等報(bào)道的合成路線中前3步縮短為1步，通過(guò)Pictet-Spengler反應(yīng)，并在鈀炭催化下脫氫，合成出Fascaplysin的C環(huán)，提高了總收率。但當(dāng)苯乙二醛的苯環(huán)上有吸電子基團(tuán)或苯環(huán)換成缺電子芳環(huán)時(shí)，苯乙二醛的制備會(huì)變得較為困難。

圖7 Bharate等報(bào)道的Fascaplysin全合成路線Figure 7 Total synthesis route of Fascaplysin reported by Bharate et al

2013年，Zhidkov等[23]又報(bào)道，以β-咔啉為原料，在微波條件下，通過(guò)Minisci反應(yīng)，可得到合成Fascaplysin的重要中間體（見圖8），單步收率為65%。另外，Zhu等[24]以色胺和鄰溴苯乙酮為原料，在碘和過(guò)氧化氫催化下也得到該中間體（見圖9），收率達(dá)96%。這2種方法均以易得到的苯甲醛代替了苯乙二醛，有利于合成E環(huán)為缺電子環(huán)的Fascaplysin衍生物。

圖8 Zhidkov等報(bào)道的Fascaplysin重要中間體合成方法Figure 8 Synthesis strategy of the important intermediate of Fascaplysin reported by Zhidkov et al

圖9 Zhu等報(bào)道的Fascaplysin重要中間體合成方法Figure 9 Synthesis strategy of the important intermediate of Fascaplysin reported by Zhu et al

3 Fascaplysin的結(jié)構(gòu)改造

為了尋找活性更好、毒副作用更小的Fascaplysin衍生物，目前對(duì)Fascaplysin的結(jié)構(gòu)改造主要有2種思路。其中一種是，保留Fascaplysin的五環(huán)母核，在母核上引入不同取代基[25]。此思路針對(duì)的改造部位主要集中在Fascaplysin的3和10位，取代基以鹵素最為常見。2007年，Zhidkov等[2]首次合成了3和10位分別及同時(shí)溴代的Fascaplysin衍生物（2a～2c），2010年，Kuzmich等[26]則對(duì)3和10位分別溴代的Fascaplysin衍生物（2a和2b）進(jìn)行了生物活性測(cè)試，結(jié)果，采用 MTS法進(jìn)行的細(xì)胞活力檢測(cè)顯示，這2個(gè)衍生物對(duì)多種腫瘤細(xì)胞株均具有納摩爾級(jí)的抑制活性（見表1）。

表1 MTS法所測(cè)衍生物2a和2b對(duì)各種腫瘤細(xì)胞株的抑制活性Table 1 Inhibitory activities of derivatives 2a and 2b on different tumor cell lines determined by the MTS method

對(duì)Fascaplysin的另一種改造思路是，通過(guò)開環(huán)破壞其母核的平面結(jié)構(gòu)，減弱其對(duì)DNA的嵌合作用，以降低毒性。此思路針對(duì)的改造部位主要集中在Fascaplysin的C和D環(huán)上。Garcia等[27]將Fascaplysin的D環(huán)打開，合成了1位取代的咔啉類化合物（3），其對(duì)CDK4的IC50為39 μmol·L-1。由于D環(huán)打開后，C與E環(huán)的相對(duì)位置發(fā)生了扭轉(zhuǎn)，羰基及咔啉環(huán)上的NH可與CDK4鉸鏈區(qū)形成氫鍵，而與羰基連接的苯環(huán)則伸向CDK4 Phe93處一個(gè)特殊的π鍵堆積口袋（π-stacking pocket）內(nèi)側(cè)，并與該區(qū)域形成較強(qiáng)的π—π絡(luò)合作用，然而，這類化合物對(duì)CDK4的抑制活性較Fascaplysin降低20～50倍。為增強(qiáng)這類化合物的活性，該研究小組將化合物伸向CDK4 π鍵堆積口袋內(nèi)的苯環(huán)換成聯(lián)苯，結(jié)果，所得化合物4對(duì)CDK4的抑制活性（IC50=77 μmol·L-1）反而繼續(xù)下降，推測(cè)可能是由于聯(lián)苯基團(tuán)體積過(guò)大所致。

Aubry等[28]則嘗試將Fascaplysin的C和D環(huán)均打開，合成了3個(gè)衍生物（5a～5c），但活性測(cè)試結(jié)果顯示，它們對(duì)CDK4的抑制活性均較Fascaplysin下降100倍左右，IC50分別為 70、50 和 50 μmol·L-1。

此后，該研究小組又進(jìn)一步對(duì)Fascaplysin進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，合成了以化合物6、7和8為母核的3個(gè)系列衍生物，并通過(guò)活性測(cè)試，篩選出活性較好的衍生物CA224（9）和CA199（10）。

DNA嵌合試驗(yàn)顯示，即使在100 μmol·L-1的高濃度下，CA224和CA199也均無(wú)對(duì)DNA的嵌合作用，而Fascaplysin就是在5.5 μmol·L-1的低濃度時(shí)也會(huì)與DNA嵌合。且CA224和CA199對(duì)CDK4的IC50分別為6和20 μmol·L-1，而對(duì)CDK2的抑制活性較低，IC50均大于500 μmol·L-1，可見它們較好地保留了Fascaplysin的選擇性抑制活性。細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)顯示，CA199有效抑制多種腫瘤細(xì)胞株生長(zhǎng)的濃度在10～40 μmol·L-1范圍內(nèi)，其能將細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期；CA224也對(duì)多種癌細(xì)胞株具有較好的抑制活性，其中對(duì)LS174T結(jié)腸癌細(xì)胞株和A549肺癌細(xì)胞株的IC50達(dá)3.5 μmol·L-1，對(duì)PC3前列腺癌細(xì)胞株的IC50為6.2 μmol·L-1。另外，從計(jì)算機(jī)模擬的CA224與CDK4結(jié)合模型（見圖10）可見，CA224中的聯(lián)苯結(jié)構(gòu)可伸入CDK4的π鍵堆積口袋，增強(qiáng)了其與該區(qū)域的結(jié)合力，而其對(duì)CDK2的IC50則為521 μmol·L-1。不過(guò)，研究表明，當(dāng)CA224中二聯(lián)苯結(jié)構(gòu)擴(kuò)增至三聯(lián)苯時(shí)，其活性下降6倍[19,29-31]。

圖10 CA224與CDK4結(jié)合模型Figure 10 Binding model of CA224 to CDK4

接著，該研究小組又嘗試將Fascaplysin的C環(huán)上12a與12b之間的碳碳鍵打開，設(shè)計(jì)合成了2個(gè)系列的雙吲哚類衍生物（11a～11j和12a～12e），其中系列化合物11中11i和11j對(duì)CDK4的IC50分別為38和44 μmol·L-1。對(duì)系列化合物12的雙吲哚之間碳鏈長(zhǎng)度與其活性的關(guān)系研究顯示，當(dāng)碳鏈長(zhǎng)度大于2個(gè)碳原子時(shí)，隨著碳鏈增長(zhǎng)，化合物活性遞減（見表2）[32]。

表2 系列化合物12的雙吲哚之間碳鏈長(zhǎng)度與其活性的關(guān)系Table 2 Relationship between the coupling carbon chain lengths of indole-indole in compounds 12 and their activities

4 結(jié)語(yǔ)

Fascaplysin作為海洋天然產(chǎn)物具有特殊的五環(huán)結(jié)構(gòu)，能高效選擇性抑制抗腫瘤靶標(biāo)CDK4激酶，這激發(fā)了人們以Fascaplysin為先導(dǎo)化合物研究與開發(fā)抗腫瘤藥物的熱情。近年來(lái)，對(duì)Fascaplysin的結(jié)構(gòu)改造主要是破壞其五環(huán)母核，以降低其對(duì)DNA的嵌入能力，從而減少其毒副作用，但這種改造策略也同時(shí)會(huì)對(duì)其活性和選擇性產(chǎn)生較大影響。筆者認(rèn)為，F(xiàn)ascaplysin的五環(huán)結(jié)構(gòu)是其能選擇性抑制CDK4的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，在保留其五環(huán)母核的基礎(chǔ)上，通過(guò)引入側(cè)鏈的方式降低其對(duì)DNA的嵌合作用，可能為其結(jié)構(gòu)改造策略的更優(yōu)選擇。另外，F(xiàn)ascaplysin與CDK4結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)尚無(wú)報(bào)道，這也限制了對(duì)Fascaplysin的結(jié)構(gòu)優(yōu)化。相信隨著對(duì)Fascaplysin與CDK4結(jié)合模式探索的深入，開發(fā)選擇性CDK4抑制劑定會(huì)有新的突破。

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