童穎，潘虹，孫成龍，辛?xí)造?，丁? ，馬鵬程

（1.中國藥科大學(xué)藥物分析教研室，江蘇 南京 210009；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院，江蘇 南京 210042）

二丙酸倍他米松（betamethasone dipropionate）是一種強效外用糖皮質(zhì)激素[1]，在靶器官中會水解為其活性代謝產(chǎn)物倍他米松（betamethasone）[2]，具有抗炎、止癢、血管收縮等作用，常用于治療銀屑病和激素敏感性皮膚病[3]。據(jù)文獻[4-5]報道，盡管皮膚局部給藥避免了藥物體內(nèi)吸收，但長期大量使用可能引起藥物的系統(tǒng)暴露量過大，從而引發(fā)糖皮質(zhì)激素類藥物常見的不良反應(yīng)。因此，需要建立靈敏的方法測定二丙酸倍他米松及其代謝物倍他米松的血藥濃度，用于評價藥物的安全性。國內(nèi)外主要采用HPLC法[6-7]、GC-MS法[8]和HPLC-MS/MS法[9-11]測定血漿中的倍他米松濃度，而血漿中原形藥物二丙酸倍他米松的濃度測定未見報道。GC-MS法的樣品前處理步驟煩瑣，不利于高通量樣本分析。而現(xiàn)有的LC-MS/MS法靈敏度低且測定成分單一，不適合生物樣本分析。本文建立了同時測定小型豬血漿中二丙酸倍他米松及其代謝物倍他米松的LC-MS/MS法，定量下限分別為25和10 ng·L-1，該分析方法高效、準確、靈敏，可用于二丙酸倍他米松及其代謝物倍他米松的藥動學(xué)研究。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260液相色譜–API 4000質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS/MS），配有雙高壓泵、自動進樣器、柱溫箱、電噴霧離子化接口、流動注射泵、三重四極桿質(zhì)譜檢測器等；色譜工作站：Analyst 1.5.2系統(tǒng)軟件（加拿大）。

1.2 藥品和試劑

二丙酸倍他米松乳膏（規(guī)格：以倍他米松計0.05%，批號：2013001）；二丙酸倍他米松對照品（批號：130503，含量：99.6%）；倍他米松對照品（批號：Y-08301，含量：98.7%），均由重慶華邦制藥有限公司提供；布地奈德對照品（內(nèi)標，批號：100989-200801；含量：99.4%）購自中國藥品生物制品檢定所；甲醇、乙腈為色譜純，購自德國Merck公司；乙酸、乙酸銨、乙醚等試劑均為分析純，購自南京化學(xué)試劑有限公司；環(huán)己烷為分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；實驗用水為去離子純凈水。

1.3 動物

巴馬小型豬，2～3月齡，8～12 kg，雌雄各半，泰州泰和生物科技有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2011-0002。

2 方法

2.1 實驗條件

色譜柱：Hedera ODS-2（150 mm×2.1 mm，5 μm，江蘇漢邦科技有限公司）；流動相：5 mmol·L-1醋酸銨水溶液（含0.1%乙酸）（A）-甲醇（B）。梯度洗脫程序：0—3.8 min，73% B；3.8—3.9 min，由 73% B 變至 100%B；3.9—8.9 min，100% B；8.9—9 min， 由 100% B變至73% B；9—13 min，73% B。流速：0.7 mL·min-1。柱溫：38 ℃。進樣量15 μL。多反應(yīng)離子檢測（MRM）；大氣壓化學(xué)離子化（APCI）；離子極性：負離子；檢測離子選擇：二丙酸倍他米松，m/z 563.2→483.1；倍他米松，m/z 451.2→361.0；布地奈德（內(nèi)標），m/z 489.3→357.1；碰撞氣壓力：4 psi（1psi=6.895 kPa）；氣簾氣壓力：20 psi；離子源氣體1壓力：30 psi；霧化電流：-1 μA；輔助加熱溫度：300 ℃。其他相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)條件見表1。其二級質(zhì)譜圖見圖1。

表1 待分析物相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)條件Table 1 Optimized MS parameters for the analytes

圖1 待分析物的二級質(zhì)譜圖Figure 1 The secondary mass spectrum of analytes

2.2 對照品溶液的配制

精密稱取二丙酸倍他米松對照品10.78 mg，倍他米松對照品10.76 mg（相當于二丙酸倍他米松10.74 mg，倍他米松10.62 mg），分別置于10 mL量瓶中，加入乙腈溶解并定容至刻度，搖勻，即得1.074 g·L-1的二丙酸倍他米松儲備液和1.062 g·L-1的倍他米松儲備液，分別用乙腈逐級稀釋，得到質(zhì)量濃度分別為25.78、17.18、10.74、5.155、2.578、1.074 μg·L-1的二丙酸倍他米松標準溶液和濃度分別為25.49、16.99、10.62、5.098、2.549、1.274、0.424 8 μg·L-1的倍他米松標準溶液。精密稱取布地奈德對照品10.20 mg（相當于布地奈德10.14 mg），置于10 mL量瓶中，加乙腈溶解并定容至刻度，搖勻，即得1.014 g·L-1的布地奈德儲備液。取該儲備液適量，稀釋至所需質(zhì)量濃度 202.8 μg·L-1。

2.3 血漿樣品的處理

血漿樣品于冰水浴中化凍后，精密量取1 mL于10 mL玻璃離心管中，加入內(nèi)標標準溶液（布地奈德質(zhì)量濃度為202.8 μg·L-1）20 μL，渦旋混勻，再加入提取溶劑乙醚-環(huán)己烷（4∶1）5 mL，乙酸（5%）100 μL，立即渦旋3 min，于4 000 r·min-1下離心10 min。取上層有機相至另一玻璃離心管中，于25 ℃水浴以氮氣流吹干。提取好的血漿樣品放置于-20 ℃冰箱中保存。測定前用100 μL乙腈-水（50∶50）復(fù)溶液復(fù)溶，渦旋3 min，轉(zhuǎn)移至1.5 mL塑料離心管中，于15 600 r·min-1下離心3 min，取上清液至自動進樣器樣品瓶中，進樣量15 μL，進行HPLC-MS/MS分析。

2.4 實驗方案

取小型豬3只，對其背部及肋腹部皮膚進行清理后單次給藥（2 mg·cm-2），給藥面積按20%體表面積計算[小型豬體表面積（BSA，單位：m2）計算公式[12]：BSA=0.121BW0.575，其中BW表示體質(zhì)量，單位為kg]，將稱量的二丙酸倍他米松乳膏置于給藥部位，然后用帶橡膠指套的手指涂抹藥物，接觸藥物的材料在接觸前和接觸后均稱重，以計算實際給藥量。給藥后約10 min用紗布覆蓋，然后用繃帶包裹固定，給藥24 h后去除藥物，清洗給藥部位。

分別于給藥前采集空白血，給藥后0.5、1、2、3、4、5、6、8、10、12、24、36、48 h采集靜脈血4 mL，離心取血漿-70 ℃保存，待測。用LC-MS/MS法測定血漿中二丙酸倍他米松及其代謝物倍他米松的濃度，采用BAPP軟件計算藥動學(xué)參數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 特異性考察

二丙酸倍他米松、倍他米松和內(nèi)標的保留時間分別為3.91、1.20、2.37 min，無雜峰干擾測定，色譜圖見圖2。

圖2 待分析物的特異性色譜圖Figure 2 Chromatograms of specificity test for analytes

3.2 標準曲線制備及定量下限

取10 mL玻璃離心管數(shù)支，分別精密加入適量的二丙酸倍他米松、倍他米松標準溶液，以氮氣流吹干后加入空白血漿1 mL，渦旋混勻，配成含二丙酸倍他米松26.85、26.85、64.44、128.9、268.5、429.6、644.4 ng·L-1， 倍他米松質(zhì)量濃度為10.62、31.86、63.72、127.4、265.5、424.8、637.2 ng·L-1的標準含藥血漿，按“2.3”項下方法操作，并同時制備空白樣品，繪制標準曲線。分別計算二丙酸倍他米松、倍他米松峰面積（As）和內(nèi)標峰面積（Ai）的比值f（f=As/Ai），以f對血藥濃度C作權(quán)重回歸計算，得二丙酸倍他米松的回歸方程：f=2.10×10-3C+1.50×10-3（r=0.998 3），倍他米松的回歸方程：f=9.60×10-3C－2.23×10-2（r=0.997 4），權(quán)重系數(shù)（ω）=1/C2。結(jié)果顯示，二丙酸倍他米松血藥濃度在26.85～644.4 ng·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低定量限為26.85 ng·L-1，信噪比大于10；倍他米松血藥濃度在10.62～637.2 ng·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低定量限為10.62 ng·L-1，信噪比大于10。

3.3 精密度與準確度實驗

制備二丙酸倍他米松質(zhì)量濃度分別為53.70、161.1、483.3 ng·L-1，倍他米松質(zhì)量濃度分別為26.55、106.2、477.9 ng·L-1的標準含藥血漿，每個濃度各配制5份樣品，按“2.3”項下方法操作，計算樣品和內(nèi)標峰面積的比值f，將f代入隨行標準曲線方程，計算各樣品的質(zhì)量濃度，連續(xù)測定3批樣品，根據(jù)3批樣品濃度的實測值計算該方法的準確度與精密度，結(jié)果見表2。本方法的準確度與精密度符合生物樣品分析要求。

3.4 提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)實驗

按文獻[13-14]報道的方法，配制并處理二丙酸倍他米松質(zhì)量濃度分別為 53.70、161.1、483.3 ng·L-1，倍他米松質(zhì)量濃度分別為26.55、106.2、477.9 ng·L-1的標準含藥血漿，考察提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)（ME）。測得血漿中內(nèi)標的回收率為(109.8±5.5) % (n=15)，ME為(101.2±6.3) % (n=18)，血漿中二丙酸倍他米松、倍他米松回收率及ME見表2。結(jié)果表明，本實驗條件下二丙酸倍他米松、倍他米松和內(nèi)標的回收率均良好，血漿基質(zhì)對其離子化及測定無影響。

表2 血漿中二丙酸倍他米松和倍他米松LC-MS/MS測定方法的精密度、準確度、回收率和基質(zhì)效應(yīng)()Table 2 Precision, accuracy, recovery and matrix effect data for the analysis of betamethasone dipropionate and betamethasone in miniature pig plasma by LC-MS/MS method

表2 血漿中二丙酸倍他米松和倍他米松LC-MS/MS測定方法的精密度、準確度、回收率和基質(zhì)效應(yīng)()Table 2 Precision, accuracy, recovery and matrix effect data for the analysis of betamethasone dipropionate and betamethasone in miniature pig plasma by LC-MS/MS method

藥物 質(zhì)量濃度/(ng·L-1) 批內(nèi)RSD/% 批間RSD/% 準確度/% 回收率/% 基質(zhì)效應(yīng)/%二丙酸倍他米松倍他米松53.70 5.7 6.1 98.8 ± 8.0 98.0 ± 8.8 103.9 ± 3.6 161.1 1.9 2.1 94.8 ± 6.5 102.9 ± 6.2 101.1 ± 6.4 483.3 3.9 4.4 98.9 ± 3.1 106.4 ± 6.0 100.1 ± 5.5 26.55 11.9 5.9 104.6 ± 9.9 96.9 ± 6.4 97.3 ± 7.2 106.2 7.8 1.5 94.2 ± 7.5 96.0 ± 7.7 90.1 ± 2.7 477.9 8.1 12.5 97.3 ± 8.2 96.5 ± 7.4 98.2 ± 5.3

3.5 穩(wěn)定性考察

配制二丙酸倍他米松質(zhì)量濃度分別為53.70和483.3 ng·L-1，倍他米松質(zhì)量濃度分別為26.55和477.9 ng·L-1的標準含藥血漿樣品若干份。其中3份按“2.3”項下方法操作處理后，立即進樣測定，另取3份室溫放置1.5 h、3份冰水浴放置2.5 h、3份反復(fù)凍融3次及3份-20 ℃冰凍放置54 d，考察血漿樣品穩(wěn)定性；同時考察血漿樣品提取后的殘渣于室溫放置及-20 ℃冰凍狀態(tài)放置，血漿樣品提取后的殘渣復(fù)溶液于進樣器中放置及-20 ℃冰凍狀態(tài)放置條件下的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，二丙酸倍他米松、倍他米松的穩(wěn)定性良好。

3.6 藥動學(xué)研究

3只小型豬背部及肋腹部皮膚清理后分別單次給予二丙酸倍他米松乳膏（2 mg·cm-2），測得小型豬血漿中倍他米松的平均血藥濃度-時間曲線見圖3，采用BAPP進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，其主要藥動學(xué)參數(shù)見表3。

二丙酸倍他米松濃度的最大值為51.09 ng·L-1，約有90 %的樣品測得的二丙酸倍他米松血藥濃度低于定量下限（26.85 ng·L-1），無法估算其藥動學(xué)參數(shù)，且無法作出其平均血藥濃度-時間曲線。

圖3 3只小型豬外用二丙酸倍他米松乳膏后其血漿中倍他米松的平均血藥濃度-時間曲線Figure 3 The mean plasma concentration-time profile of betamethasone in miniature pig plasma after transdermal administration with betamethasone dipropionate cream

表3 3只小型豬外用二丙酸倍他米松乳膏后其體內(nèi)倍他米松的主要藥動學(xué)參數(shù)Table 3 The main pharmacokinetic parameters of betamethasone in three miniature pigs after transdermal administration with betamethasone dipropionate cream

4 討論

二丙酸倍他米松和倍他米松為糖皮質(zhì)激素類藥物，血 漿中存在與其結(jié)構(gòu)相似的內(nèi)源性物質(zhì)，會對其產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)。文獻[11,15]采用ESI離子化方式，本研究發(fā)現(xiàn)ESI離子化方式存在明顯的基質(zhì)效應(yīng)，導(dǎo)致其響應(yīng)不穩(wěn)定，無法準確定量。根據(jù)文獻[16]報道，可以通過改變離子化方式解決樣本的基質(zhì)效應(yīng)。液質(zhì)聯(lián)用中3種常用的大氣壓離子化方式的抗基質(zhì)干擾能力依次為：APPI>APCI>ESI，經(jīng)考察，待測物質(zhì)在APCI模式下的基質(zhì)效應(yīng)較小，符合生物樣本檢測的相關(guān)要求，故選擇APCI離子化方式。但在APCI模式下監(jiān)測待測物的[M+H]+，靈敏度達不到準確定量的要求，所以需要更換監(jiān)測離子以達到更高的靈敏度。通過試驗發(fā)現(xiàn)，待測物形成的加合離子[M+CH3COO]-靈敏度最高。當在流動相中加入一定量的乙酸銨后，其靈敏度達到準確定量的要求，并且能形成穩(wěn)定的離子峰。因此，最終選擇在APCI模式下監(jiān)測[M+CH3COO]-。

在流動相中加入適當?shù)奶砑觿┛梢愿淖兇郎y物的保留時間，改善峰形。筆者所在課題組曾比較了在流動相中分別加入不同量的甲酸和乙酸的效果。加入甲酸后，HCOO-和CH3COO-競爭形成待測物的加合離子，使待測物的響應(yīng)明顯降低，且不穩(wěn)定，故選擇乙酸作為添加劑。研究發(fā)現(xiàn)，當加入0.1%的乙酸，待測物峰形良好。同時采用梯度洗脫程序進一步解決基質(zhì)效應(yīng)。

根據(jù)小型豬血漿樣品測定結(jié)果，二丙酸倍他米松的血藥濃度最大值為51.09 ng·L-1，約有90%的樣品測得的二丙酸倍他米松血藥濃度低于定量下限。二丙酸倍他米松乳膏是皮膚外用藥，由于透皮吸收的限制，導(dǎo)致其入血量較少；另外，二丙酸倍他米松作為前藥，在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為其活性代謝產(chǎn)物倍他米松。故二丙酸倍他米松的系統(tǒng)暴露量極低。倍他米松的系統(tǒng)暴露量也較低（pg級），說明該皮膚外用制劑安全性較好。

本研究采用2～3月齡的小型豬，其皮膚的生理形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)、免疫功能等與人最為接近[17]，且給藥劑量為臨床應(yīng)用的最大劑量，其藥動學(xué)參數(shù)可為臨床研究提供一定參考。本實驗建立了小型豬血漿中二丙酸倍他米松及其代謝物倍他米松的LC-MS/MS同時測定方法，符合生物樣本測定的要求，可為治療藥物的臨床血藥濃度監(jiān)測和藥動學(xué)研究提供參考。

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