單曉政+文正華+劉莉莉+姚星偉+江漢民+吳峰+牛國保+孫德嶺

摘 要：以松散型花椰菜子葉型小孢子胚為外植體，研究冷處理、活性炭及AgNO3對小孢子植株再生的影響。結(jié)果表明：對小孢子胚進行3 d的4 ℃冷處理培養(yǎng)，能提高其胚芽誘導(dǎo)率和胚芽數(shù)；培養(yǎng)基中添加1.0 g·L-1的活性炭對提高小孢子胚芽誘導(dǎo)率沒有明顯效果，但能有效減輕胚芽的玻璃化；添加5.0～7.0 mg·L-1的AgNO3對小孢子胚芽誘導(dǎo)有顯著效果。

關(guān)鍵詞：松散型花椰菜；小孢子胚；植株再生

中圖分類號：S635.3 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.06.001

相對于緊實型花椰菜，松散型花椰菜花球松散、梗青球白、生脆可口、味道鮮美，近年來逐漸贏得我國消費者的喜愛，種植面積不斷擴大。利用游離小孢子技術(shù)獲得松散型花椰菜小孢子植株或DH群體已有報道[1]，雖然松散型花椰菜小孢子培養(yǎng)的產(chǎn)胚率相對較高，但小孢子胚在分化和繼代培養(yǎng)中，仍然存在褐化、玻璃化、愈傷化、停止生長和畸形生長等現(xiàn)象，直接影響小孢子植株的再生率。已有報道稱基因型、胚齡、瓊脂濃度、培養(yǎng)基添加物等都是影響小孢子植株再生的重要因素[2-3]，而適當?shù)睦涮幚怼⒏稍锾幚?、子葉切除等能提高小孢子胚的植株再生能力。

本文探討了冷處理、活性炭和AgNO3對松散型花椰菜小孢子植株再生的影響，旨在進一步完善游離小孢子培養(yǎng)體系，并為該技術(shù)在蔬菜育種中的應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材 料

‘津松65、‘津松70等8個松散型花椰菜品種由天津科潤蔬菜研究所花椰菜課題組提供。

1.2 方 法

將供試材料進行游離小孢子培養(yǎng)，培養(yǎng)方法參考顧宏輝[1]的方法，將獲得的子葉型小孢子胚狀體置于光照下，轉(zhuǎn)綠后，即可用于小孢子胚芽誘導(dǎo)試驗。將變綠后的子葉型胚轉(zhuǎn)入基本培養(yǎng)基（MS+6-BA0.2 mg·L-1+蔗糖30.0 g·L-1+瓊脂13.5 g·L-1）中進行培養(yǎng)，其中以高出胚率品種‘津松65和‘津松70的小孢子胚為試材，研究冷處理、活性炭和AgNO3對小孢子胚芽誘導(dǎo)的影響。3種處理設(shè)置條件為：將剛轉(zhuǎn)入固體培養(yǎng)基的胚置于光照培養(yǎng)箱中4 ℃冷處理3 d，以冷處理0 d為對照；在基本培養(yǎng)基中添加1.0 g·L-1活性炭，以不添加活性炭為對照；在基本培養(yǎng)基中分別添加1.0，3.0，5.0，7.0，9.0 mg·L-1的AgNO3，以不添加AgNO3為對照。每個處理接種小孢子胚24個，3次重復(fù)，25 d后統(tǒng)計胚芽誘導(dǎo)率和胚芽數(shù)。胚芽誘導(dǎo)率=出芽胚狀體數(shù)/接種胚狀體數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷處理對小孢子胚芽再生的影響

對2個供試材料的小孢子胚進行3 d的冷處理后，胚芽誘導(dǎo)率和出芽數(shù)均有顯著提高（表1）。經(jīng)冷處理后，‘津松65的胚芽誘導(dǎo)率由52.0%提高到了83.0%，平均出芽數(shù)也由2.37 個·胚-1增加到2.89個·胚-1，‘津松70的胚芽誘導(dǎo)率由61.8.0%提高到88.3%，而平均出芽數(shù)由0.68個·胚-1提高到了1.83個·胚-1。

2.2 活性炭對小孢子胚芽再生的影響

活性炭處理后，2個供試材料的小孢子胚芽誘導(dǎo)率和出胚數(shù)與對照相比差異不顯著（表2）。

但在添加活性炭的培養(yǎng)基中生長的胚芽出現(xiàn)玻璃化的概率減小，并且長成的幼苗比較健壯，成活率較高，而未添加活性炭的培養(yǎng)基中的胚芽玻璃化現(xiàn)象較嚴重。

2.3 AgNO3在小孢子胚芽再生中的作用

從表3可以看出，在培養(yǎng)基中分別添加5.0～7.0 mg·L-1的AgNO3，小孢子胚芽分化率和胚平均出芽數(shù)與不添加AgNO3相比均差異顯著?！蛩?5在添加7.0 mg·L-1的AgNO3時，胚芽誘導(dǎo)率提高到83.7%，添加了5.0 mg·L-1的AgNO3后，平均出芽數(shù)達到2.85個·胚-1，‘津松70在添加5.0 mg·L-1的AgNO3后，胚芽誘導(dǎo)率提高到98.2%，而平均出芽數(shù)由0.76個·胚-1提高到了2.26個·胚-1。這表明在培養(yǎng)基中附加5.0～7.0 mg·L-1的AgNO3可顯著提高松散型花椰菜小孢子胚芽誘導(dǎo)率和每個胚狀體分化芽的數(shù)量。

2.4 再生苗的繼代、生根和移栽

將獲得的胚芽切下接種到繼代培養(yǎng)基中，之后每20～30 d繼代1次，可以使芽苗長得健壯。經(jīng)繼代3～4次的芽苗接種到含NAA的生根培養(yǎng)基中，15 d左右即可長出健壯的根系，通常經(jīng)繼代的芽苗較不經(jīng)繼代的芽苗生根速度快、根短粗、成活率高。將組培苗移栽到自然環(huán)境生長前要煉苗1～2 d，之后移栽于含蛭石∶草炭（1∶2）的營養(yǎng)缽中，并進行遮蔭保濕。

3 結(jié)論與討論

冷處理、活性炭和AgNO3在小孢子培養(yǎng)中的作用已有大量報道，但在小孢子植株再生中的作用研究較少。Ritala[4]對大麥小孢子胚進行4個星期的4 ℃處理，可以明顯提高生成苗的效率；周偉軍等[5]對油菜小孢子再生研究時發(fā)現(xiàn)，在胚狀體移入固體再生培養(yǎng)基后立即進行10 d的低溫誘導(dǎo)處理（2 ℃），常溫光下培養(yǎng)，可以直接、快速再生成苗，成苗率達62.5%，且再生植株的生長狀況與無低溫誘導(dǎo)的再生植株無明顯區(qū)別；Zhang[6]對油菜小孢子胚狀體進行3 d或5 d的冷處理，能使胚發(fā)芽率和成苗率分別提高到90.0%和58.48%。本試驗將小孢子胚在4 ℃處理3 d，發(fā)現(xiàn)胚芽誘導(dǎo)率最高可達到90%以上，說明冷處理對提高胚芽的再生確實有效。

韓陽[7]在大白菜小孢子植株再生研究中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加200 mg·L-1活性炭可以大幅度提高小孢子胚成苗率，其原理可能是活性炭吸附了瓊脂中不利于細胞生長的某些物質(zhì)。其他研究者也曾報道活性炭對小孢子胚狀體發(fā)生有很好的促進作用。本研究發(fā)現(xiàn)添加活性炭與未添加活性炭小孢子胚芽誘導(dǎo)無明顯差異，這可能跟活性炭濃度有關(guān)，活性炭濃度較高反而對胚芽誘導(dǎo)沒有明顯促進作用。但是，本試驗中發(fā)現(xiàn)，在添加活性炭的培養(yǎng)基中生長的胚芽在之后的培養(yǎng)中玻璃化現(xiàn)象明顯減輕，這說明活性炭可能在克服小孢子胚芽玻璃化方面有重要作用。

AgNO3作為一種乙烯抑制劑經(jīng)常被用于植物離體培養(yǎng)中。許多研究指出，在植物離體培養(yǎng)中，AgNO3不僅能提高芽誘導(dǎo)率，還能有效抑制褐化。唐桂香[8]發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加AgNO3能顯著提高甘藍型油菜子葉的不定芽分化誘導(dǎo)率。趙秀樞[9]發(fā)現(xiàn)，AgNO3在羽衣甘藍不定芽誘導(dǎo)過程中起抑制作用。高紅亮[10]在不結(jié)球白菜離體再生研究中發(fā)現(xiàn)添加5～10 mg·L-1AgNO3可顯著提高不定芽分化率和每個外植體分化芽的數(shù)量。楊曉楓[11]發(fā)現(xiàn)，甘藍型油菜外植體愈傷組織誘導(dǎo)率和芽再生率與AgNO3密切相關(guān)。本試驗將AgNO3用于松散型花椰菜小孢子植株再生中，也發(fā)現(xiàn)適宜濃度的AgNO3在一定程度上提高了松散型花椰菜小孢子胚芽誘導(dǎo)率和再生率，但濃度過高對胚芽再生起抑制作用。

參考文獻：

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