陳永鋒 辛甜甜 王曉華 陳文靜 蔡碧珊 薛耀華

尋常性銀屑病患者外周血Th22細(xì)胞及其白細(xì)胞介素22的表達(dá)

陳永鋒 辛甜甜 王曉華 陳文靜 蔡碧珊 薛耀華

目的探討尋常性銀屑病患者外周血Th22細(xì)胞及相關(guān)因子白細(xì)胞介素22(IL-22)表達(dá)水平與疾病嚴(yán)重程度及病程的相關(guān)性。方法抽取40例尋常性銀屑病患者和30例健康對照者外周血,流式細(xì)胞儀檢測外周血Th22細(xì)胞比例,ELISA法檢測血清中IL-22的表達(dá)。采用t檢驗、Pearson相關(guān)分析法進(jìn)行分析。結(jié)果尋常性銀屑病患者外周血Th22細(xì)胞百分比(0.65%±0.48%)高于健康對照組(0.33%±0.15%),兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.89,P＜0.01);銀屑病患者Th22細(xì)胞與銀屑病病情嚴(yán)重度評分(PASI)呈正相關(guān)(r=0.38,P＜0.05),但與病程無相關(guān)性(r=0.20,P＞0.05)。銀屑病患者血清中IL-22表達(dá)水平[(67.96±14.32)ng/L]高于健康對照組[(40.59±9.91)ng/L],兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.45,P＜0.01);銀屑病患者血清IL-22表達(dá)水平與PASI呈正相關(guān)(r=0.94,P＜0.01),與病程無相關(guān)性(r=0.10,P＞0.05)。結(jié)論Th22細(xì)胞及IL-22在尋常性銀屑病外周血中有高表達(dá),且Th22細(xì)胞及IL-22水平均與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。

銀屑病;CD4+T細(xì)胞;Th22細(xì)胞;白細(xì)胞介素22

Th22是近年來發(fā)現(xiàn)的一種不同于Th1、Th2及Th17的新型CD4+T細(xì)胞,特征性地表達(dá)CCR6、CCR4和CCR10,分泌白細(xì)胞介素22(IL-22)、腫瘤壞死因子 α(TNF-α),而不產(chǎn)生 IL-4、IL-17和干擾素γ(IFN-γ)[1-3]。Th22具有獨(dú)立的分化和發(fā)育調(diào)節(jié)機(jī)制,在自身免疫性疾病、感染性疾病以及組織修復(fù)中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。我們用流式細(xì)胞儀檢測銀屑病患者外周血Th22細(xì)胞的表達(dá),并用ELISA檢測血清中IL-22的水平,探討Th22細(xì)胞及相關(guān)因子IL-22與銀屑病的相關(guān)性。

病例與方法

一、臨床資料

入選病例為2011年8月至2012年5月在廣東省皮膚病醫(yī)院門診及住院部確診的尋常性斑塊狀銀屑病(以下簡稱銀屑病)患者40例,其中男24例,女16例,年齡21～63歲,平均(36.63±9.28)歲;病程4個月至10年,平均(2.67±2.37)年;銀屑病病情嚴(yán)重度評分(PASI)[4]5.7～26.2,平均12.44±4.85。所選病例均符合《臨床皮膚病學(xué)》第3版[5]診斷標(biāo)準(zhǔn),所有患者近3個月內(nèi)未系統(tǒng)使用糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑,1個月內(nèi)未外用糖皮質(zhì)激素或其他制劑或接受紫外線照射等治療,無合并先天或獲得性自身免疫性疾病及其他免疫相關(guān)性或炎癥性、真菌感染疾病。對照組為健康體檢者30例,其中男17例,女13例,年齡23～53歲,平均年齡(35.30±8.43)歲;觀察前1個月內(nèi)無細(xì)菌、真菌、病毒感染,既往無銀屑病等免疫相關(guān)皮膚疾病?；颊呓M及健康對照組的性別及年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。本研究通過廣東省皮膚病醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),患者簽署知情同意書。

二、試劑和儀器

美國eBioscience公司生產(chǎn)的藻多甲素-葉綠素蛋白5.5(PerCP-Cy5.5) 抗人CD3、Alexa Fluor 488抗人CD8、藻紅蛋白(PE)抗人IL-22、別藻藍(lán)蛋白(APC) 抗人 IL-17、PE-Cy7 抗人 IFN-γ、PE 、APC、PE-Cy7鼠IgG1 K同型對照。美國Sigma公司生產(chǎn)的佛波酯肉豆蔻酸乙酸鹽(PMA)、離子霉素、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑(BFA)。聯(lián)科生物科技有限公司生產(chǎn)的IL-22 ELISA試劑盒、FIX&PERM。美國BD公司生產(chǎn)的FACS CantoⅡ型流式細(xì)胞儀。

三、方法

1.外周血Th22細(xì)胞的流式細(xì)胞儀計數(shù):采集受檢者靜脈血2 ml,肝素鈉抗凝,24 h內(nèi)檢測。取試管1支,加入RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液和抗凝血各150 μl,再加入 50 mg/L 離子霉素工作液 6 μl、1 mg/L PMA 工作液 7.5 μl、0.5 g/L BFA 工作液 6 μl,混勻,置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5 h,然后取出混勻;取2支試管,A管為實驗管,B管為同型管,各加入上述混勻液100 μl,再加入PE-Cy5-CD3和FITC-CD8各5 μl,室溫避光孵育15 min;然后兩管分別加入Fix&Perm中的Reagent A(即固定劑)100 μl,室溫避光孵育15 min;加入磷酸鹽緩沖液(PBS)3 ml,400×g離心5 min,棄上清,再加入FIX&Perm中的Reagent B(即破膜劑和溶血劑)100 μl,靜置3 min;然后A管中加入PE-Cy7-IFN-γ、APCIL-17、PE-IL-22 各 5 μl,B 管中加入 PE-Cy7-IgG1、APC-IgG1、PE-IgG1 各 5 μl,室溫避光孵育 30 min;然后兩管均加入PBS 3 ml,400×g離心5 min,棄上清,用PBS 400 μl重懸細(xì)胞,上機(jī)檢測。以FSC/SSC設(shè)門,收集20 000個淋巴細(xì)胞,圈定淋巴細(xì)胞析,檢測結(jié)果以±s表示,采用成組t檢驗分別比較兩組外周血Th22細(xì)胞比例和血清IL-22水平差異,采用Pearson相關(guān)分析法進(jìn)行相關(guān)性分析,P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、外周血Th22細(xì)胞比例及血清IL-22表達(dá)水平

銀屑病患者組外周血Th22細(xì)胞比例(0.65%±0.48%)高于健康對照組(0.33%±0.15%),兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.89,P＜0.01),見圖1。銀屑病患者組血清IL-22表達(dá)水平[(67.96±14.32)ng/L]高于健康對照組[(40.59±9.91)ng/L],兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.45,P＜0.01)。

二、相關(guān)性分析結(jié)果

銀屑病患者外周血Th22細(xì)胞比例及血清IL-22水平與PASI評分(12.44±4.85)均呈顯著正相關(guān)(r值分別為0.38和0.94,P＜0.05和 ＜0.01),而與患者病程(2.67±2.37年)均無顯著相關(guān)性(r值分別為0.20和0.10,均P＞0.05)。

討 論

Th22細(xì)胞是近幾年發(fā)現(xiàn)的新型CD4+記憶性T細(xì)胞亞群[1-3]。越來越多的證據(jù)表明,Th22細(xì)胞在自身免疫性疾病、炎癥性疾病以及組織修復(fù)中發(fā)揮重要作用[8-10]。目前發(fā)現(xiàn)此細(xì)胞參與銀屑病發(fā)病主要是通過分泌IL-22等炎癥因子作用于角質(zhì)形成細(xì)胞起作用,包括促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖,抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的正常分化以及分泌及誘導(dǎo)相關(guān)因子群為R1,在R1門內(nèi)以CD3+/SSC設(shè)門,圈定T淋巴細(xì)胞為R2,在R2門內(nèi)以CD3/CD8表達(dá)的散點(diǎn)圖中,圈定CD3+/CD8-的T淋巴細(xì)胞為R3,在R3門內(nèi)收集表達(dá)CD8-/IL-22+的細(xì)胞,即為CD3+CD4+IL-22+細(xì)胞群(通常以佛波酯、離子霉素刺激后CD4的表達(dá)會降低,以熒光觀測CD3+CD4+IL-22+比較困難,而CD8刺激后表達(dá)降低不明顯,因此用CD3+CD8-/IL-22+來代表CD3+CD4+/IL-22+細(xì)胞[6-7]);再分別以IL-17和IFN-γ設(shè)門,得到CD3+CD8-IL-22+IL-17-IFN-γ-的T淋巴細(xì)胞群即為Th22細(xì)胞,以熒光抗體染色陽性細(xì)胞的百分率記錄結(jié)果。

2.血清中IL-22的檢測:采集受檢者靜脈血3 ml,靜置留取血清500 μl,置-20℃保存待檢。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書檢測,用ELISA軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算其濃度。

3.統(tǒng)計學(xué)分析:用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分參與炎癥反應(yīng),從而引發(fā)銀屑病特征性皮損[11-15]。

圖1 銀屑病患者與健康對照組外周血Th22細(xì)胞流式細(xì)胞儀分析散點(diǎn)圖 銀屑病患者組血清IL-22的表達(dá)水平高于健康對照組,Th22細(xì)胞比例高于健康對照組 上圖為銀屑病患者組,下圖為健康對照組

我們采用流式細(xì)胞儀檢測銀屑病患者和健康對照者外周血CD4+T細(xì)胞中Th22細(xì)胞比例,檢測發(fā)現(xiàn),銀屑病患者外周血Th22細(xì)胞較健康對照組高(圖1),提示Th22細(xì)胞參與銀屑病發(fā)病,與目前國外研究結(jié)果一致[3，10，16]。 雖然研究認(rèn)為Th22主要定位于皮損[10],外周血較少,但與健康對照組相比差異仍有統(tǒng)計學(xué)意義。此外,將Th22細(xì)胞及其相關(guān)因子IL-22表達(dá)水平與PASI評分、病程作相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),Th22細(xì)胞、IL-22均與PASI評分成正相關(guān),提示Th22細(xì)胞、IL-22可反映疾病的嚴(yán)重程度,或許在后續(xù)治療中可通過監(jiān)測Th22細(xì)胞及IL-22水平的變化來評價療效。而Th22細(xì)胞、IL-22水平均與病程無相關(guān)性,可能是由于Th22及IL-22主要參與銀屑病皮損形成及發(fā)展,當(dāng)疾病緩解皮疹消退時,Th22細(xì)胞或IL-22水平即降低[17],而并非隨病程遷延而長期存在,但具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

[1]Duhen T，Geiger R，Jarrossay D，et al.Production of interleukin 22 but not interleukin 17 by a subset of human skin-homing memory T cells[J].Nat Immunol，2009，10(8):857-863.

[2]Trifari S，Kaplan CD，Tran EH，et al.Identification of a human helper T cell population that has abundant production of interleukin 22 and is distinct from Th17，Th1 and Th2 cells[J].Nat Immunol，2009，10(8):864-871.

[3]Nograles KE，Zaba LC，Shemer A，et al.IL-22-producing “T22“T cells account for upregulated IL-22 in atopic dermatitis despite reduced IL-17-producing TH17 T cells[J].J Allergy Clin Immunol，2009，123(6):1244-1252.

[4]張長宋，趙天恩，陳樹民.銀屑病病情嚴(yán)重程度評判指標(biāo)的研究現(xiàn)狀[J].國外醫(yī)學(xué)皮膚性病學(xué)分冊，2002，28(2):82-84.

[5]趙辨.臨床皮膚病學(xué)[M].3版.南京:江蘇科學(xué)技術(shù)出版社，2001:759-766.

[6]Kemp K，Bruunsgaard H.Identification of IFN-gamma-producing CD4+T cells following PMA stimulation[J].J Interferon Cytokine Res，2001，21(7):503-506.

[7]毛建華，陳志敏，湯永民，等.佛波酯對人外周血淋巴細(xì)胞CD3和CD4及CD8分子表達(dá)的作用[J].浙江大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2004，33(2):155-159.

[8]Cavani A，Pennino D，Eyerich K.Th17 and Th22 in skin allergy[J].Chem Immunol Allergy，2012，96:39-44.

[9]Truchetet ME，Brembilla NC，Montanari E，et al.Increased frequency of circulating Th22 in addition to Th17 and Th2 lymphocytes in systemic sclerosis:association with interstitial lung disease[J].Arthritis Res Ther，2011，13(5):R166.

[10]Eyerich S，Eyerich K，Pennino D，et al.Th22 cells represent a distinct human T cell subset involved in epidermal immunity and remodeling[J].J Clin Invest，2009，119(12):3573-3585.

[11]Sabat R，Wolk K.Research in practice:IL-22 and IL-20:significance for epithelial homeostasis and psoriasis pathogenesis[J].J Dtsch Dermatol Ges，2011，9(7):518-523.

[12]Eyerich S，Wagener J，Wenzel V，et al.IL-22 and TNF-α represent a key cytokine combination for epidermal integrity during infection with Candida albicans[J].Eur J Immunol，2011，41(7):1894-1901.

[13]Boniface K，Guignouard E，Pedretti N，et al.A role for T cellderived interleukin 22 in psoriatic skin inflammation[J].Clin Exp Immunol，2007，150(3):407-415.

[14]Wolk K，Witte E，Witte K，et al.Biology of interleukin-22[J].Semin Immunopathol，2010，32(1):17-31.

[15]Wolk K，Witte E，Wallace E，et al.IL-22 regulates the expression of genes responsible for antimicrobial defense，cellular differentiation，and mobility in keratinocytes:a potential role in psoriasis[J].Eur J Immunol，2006，36(5):1309-1323.

[16]Kagami S，Rizzo HL，Lee JJ，et al.Circulating Th17，Th22，and Th1 cells are increased in psoriasis[J].J Invest Dermatol，2010，130(5):1373-1383.

[17]Meephansan J，Ruchusatsawat K，Sindhupak W，et al.Effect of methotrexate on serum levels of IL-22 in patients with psoriasis[J].Eur J Dermatol，2011，21(4):501-504.

2014-03-24)

(本文編輯:周良佳 顏艷)

Frequency of T helper type 22 cells and expression of interleukin-22 in peripheral blood of patients with psoriasis vulgaris

Chen Yongfeng*，Xin Tiantian，Wang Xiaohua，Chen Wenjing，Cai Bishan，Xue Yaohua.*Guangdong Provincial Dermatology Hospital，Guangzhou 510091，China

Chen Yongfeng，Email:gdcyf@163.com

ObjectiveTo determine the frequency of T helper type 22(Th22)cells and expression level of interleukin-22(IL-22)in peripheral blood of patients with psoriasis vulgaris，and to investigate their relationship with disease severity and clinical course.MethodsPeripheral blood samples were obtained from 40 patients with psoriasis vulgaris and 30 healthy human controls.Five-color flow cytometry was performed to determine the percentage of Th22 cells in peripheral blood，and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)to measure the expression of serum IL-22.Statistical analysis was carried out byttest and Pearson correlation analysis.ResultsBoth the percentage of Th22 cells and serum level of IL-22 in peripheral blood were significantly higher in patients with psoriasis vulgaris than in healthy human controls(Th22 cells:0.65% ±0.48%vs.0.33% ±0.15%，t=3.89，P＜0.01;IL-22:(67.96 ± 14.32)vs.(40.59 ± 9.91)ng/L，t=9.45，P＜ 0.01).Further more，Th22 cell percentage and IL-22 serum level in peripheral blood were both positively correlated with psoriasis area and severity index(PASI)in these patients(r=0.38，0.94，P＜ 0.05 and 0.01，respectively)，but neither of them correlated with clinical course of psoriasis vulgaris(r=0.20，0.10，respectively，bothP＞ 0.05).Conclusions The percentage of Th22 cells and level of IL-22 are increased in peripheral blood of patients with psoriasis vulgaris，and both of them are correlated with disease severity.

Psoriasis;CD4-positive T-lymphocytes;Th22 cells;Interleukin-22

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.12.005

廣東省2010年第一批產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究與開發(fā)資金計劃項目(2010B031600115)

510091廣州,廣東省皮膚病醫(yī)院(陳永鋒、王曉華、陳文靜、蔡碧珊、薛耀華);廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院皮膚科(辛甜甜)

陳永鋒,Email:gdcyf@163.com