于瑞星 尹躍平 陳紹椿 戴秀芹 韓燕 張國毅 陳祥生

·技術(shù)與方法·

聚丙烯酰胺凝膠電泳和毛細管電泳用于淋球菌多位點串聯(lián)重復(fù)序列分型的評估

于瑞星 尹躍平 陳紹椿 戴秀芹 韓燕 張國毅 陳祥生

淋球菌是引起淋病的致病菌,淋球菌感染不僅可引起新生兒失明等嚴重的并發(fā)癥,還能夠加速其他病原體及HIV感染[1]。近年來淋球菌分型方法報道較多,目前最常用的是淋球菌多抗原序列分型(NG-MAST)和多位點序列分型(MLST)分型,但這兩種分型方法費用較高,不適合資源匱乏地區(qū)應(yīng)用。多位點串聯(lián)重復(fù)序列分型(multiple-locus variable number tandem repeat analysis,MLVA)是近年來用于淋球菌分型的一種方法,該分型方法是一種簡單、價格便宜、易操作、結(jié)果客觀的分型方法。本文的目的是比較聚丙烯酰胺凝膠電泳和毛細管電泳兩種方法進行淋球菌MLVA分型的異同,以便選擇最佳的實驗方法。

一、對象

10株淋球菌臨床分離菌株來自于中國醫(yī)學科學院皮膚病研究所2012年性病門診。標本的采集及保存方法根據(jù)2007年中國疾病預(yù)防控制中心下發(fā)的“全國淋球菌耐藥監(jiān)測實施方案”進行,收集淋球菌臨床分離菌株,經(jīng)初步鑒定后傳代1次,洗于脫脂牛奶中,-70℃冰箱保存?zhèn)溆?。標準菌株FA1090購于北京中原公司。

主要試劑:Taq DNA 聚合酶、dNTP、MgCl2、緩沖液(不含Mg+離子)、pBR322 DNA/MspⅠ PCR參照物、 丙烯酰胺、N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺、10%PBS、TEMED購于南京興生生物技術(shù)有限公司。硝酸銀、氫氧化鈉、甲醛、無水乙醇、冰醋酸購于南京化學試劑廠。Tris-borate-EDTA緩沖液購于美國Sigma公司。

二、方法

1.淋球菌DNA的提取:將保存在-70℃冰箱的淋球菌臨床分離株復(fù)蘇,接種于淋球菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基,置于36℃5%CO2培養(yǎng)箱中過夜,挑取一滿環(huán)菌,研磨至裝有1 ml的雙蒸水中,100℃加熱10 min,1 409×g離心2 min,取上清即為DNA。

2.MLVA分型:PCR反應(yīng):依據(jù)文獻[2]報道,選擇7個淋球菌串聯(lián)重復(fù)序列(variable number tandem repeat，VNTR)基因位點(表1)。聚丙烯胺凝膠方法所用引物委托英濰捷基貿(mào)易有限公司合成,毛細管電泳所用引物委托上海桑尼生物科技有限公司完成,上游引物用FAM標記。采用20 μl反應(yīng)體系,實驗濃度分別為Taq DNA聚合酶1 U,dNTP 200 μmol/L,上游引物 0.3 μmol/L,下游引物 0.3 μmol/L,MgCl22.5 μmol/L,緩沖液體積與MgCl2相同,雙蒸水補充至反應(yīng)體積。VNTR264基因位點PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min,94℃ 30 s,68℃ 30 s,70℃ 45 s,35個循環(huán)后,72℃延伸10 min。其他VNTR基因位點 PCR反應(yīng)條件:96℃預(yù)變性3 min,96℃6 s,60℃6 s,72℃10 s,40個循環(huán)。在用FAM標記的引物PCR時,注意避光。

聚丙烯酰胺凝膠電泳:VNTR264和VNTR2048基因位點PCR產(chǎn)物電泳用6%聚丙烯酰胺凝膠,其余VNTR基因位點PCR產(chǎn)物用8%聚丙烯酰胺凝膠。將上述配置成的液體混勻后快速用移液器加滿制膠板,平行放入齒梳,靜置30 min后拔掉齒梳,將2 μl樣品和1 μl溴酚藍混勻后加入加樣孔,加2 μl pBR322 DNA/MspI PCR參照物及FA1090菌株相應(yīng)VNTR基因位點的PCR產(chǎn)物。向電泳槽中倒入1×TBE電泳緩沖液,80 V 55 min后,將聚丙烯酰胺凝膠按照文獻[3]方法快速銀染。

毛細管電泳:將N002-N011淋球菌臨床分離菌株及FA1090菌株全部VNTR基因位點PCR產(chǎn)物避光-20℃保存,委托上海桑尼生物技術(shù)有限公司進行毛細管電泳。

表1 引物序列、重復(fù)片段大小及側(cè)翼大小

FA1090 菌 株測序:FA1090 菌 株 VNTR264、VNR471、VNTR947、VNTR1609、VNTR1638、VNTR2048、VNTR218 基 因 位點PCR產(chǎn)物測序委托上海桑尼生物科技有限公司完成。

3.結(jié)果分析:在PubMed利用BLAST比對,分析FA1090菌株 VNTR264、VNTR471、VNTR947、VNTR1609、VNTR1638、VNTR2048、VNTR2148基因位點 PCR產(chǎn)物測序序列與Kushnir等[4]報道是否一致。依據(jù)文獻[1]報道,參照pBR322 DNA/MspⅠ PCR marker及FA1090菌株相應(yīng)VNTR基因位點PCR產(chǎn)物的條帶位置,確定不同菌株VNTR基因位點PCR產(chǎn)物的大小范圍;然后根據(jù)表2中不同VNTR基因位點PCR產(chǎn)物大小所對應(yīng)的重復(fù)次數(shù),確定不同菌株VNTR基因位點PCR產(chǎn)物的重復(fù)次數(shù)。將上海桑尼科技有限公司毛細管電泳結(jié)果利用Peak Scanner和Gene Marker軟件分析數(shù)據(jù),確定不同VNTR基因位點PCR產(chǎn)物重復(fù)次數(shù)。

三、結(jié)果

表2 不同VNTR基因位點PCR產(chǎn)物大小所對應(yīng)的重復(fù)次數(shù)(bp)

表3 毛細管電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果比較

1.FA1090測序結(jié)果:VNTR264、VNTR471、VNTR947、VNTR1609、VNTR1638、VNTR2048和 VNTR2148基因位點的PCR產(chǎn)物測序序列與文獻[4]報道的序列一致,即這7對引物可用于相應(yīng)VNTR基因位點PCR擴增、MLVA分型。

圖1 VNTR471 PCR產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠電泳圖 1:淋球菌臨床分離菌株N008;2:標準菌株FA1090;3:標準菌株FA1090;4:淋球菌臨床分離菌株N004;5:淋球菌臨床分離菌株N002;M:標準參照物

圖2 標準菌株FA1090 VNTR471 PCR產(chǎn)物毛細管電泳圖 藍色峰為FA1090菌株VNTR PCR產(chǎn)物,黃色峰為內(nèi)標LIZ500,從左到右依次增大

圖3 VNTR947 PCR產(chǎn)物聚丙烯胺凝膠電泳圖 M:標準參照物;1:淋球菌臨床分離菌株N003;2:淋球菌臨床分離菌株N005;3:標準菌株FA1090;4:淋球菌臨床分離菌株N004

2.毛細管電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果比較:見表3。N002-N011淋球菌臨床分離菌株利用聚丙烯酰胺凝膠電泳 所 確 定 的 VNTR264、VNTR471、VNTR947、VNTR1609、VNTR1638、VNTR2048、VNTR2148 基因位點 PCR 產(chǎn)物重復(fù)次數(shù)與毛細管電泳所得結(jié)果一致。如圖1～4,FA1090菌株VNTR471及VNTR947 PCR產(chǎn)物利用聚丙烯酰胺凝膠電泳與毛細管電泳結(jié)果一致。FA1090菌株VNTR264基因位點PCR產(chǎn)物用聚丙烯酰胺凝膠電泳確定其重復(fù)次數(shù)為3,利用毛細管電泳不能確定其重復(fù)次數(shù),而其他6個基因位點PCR產(chǎn)物利用這兩種方法所確定的重復(fù)次數(shù)一致。

圖4 標準菌株FA1090 VNTR 947引物PCR產(chǎn)物毛細管電泳圖 藍色峰為FA1090菌株VNTR PCR產(chǎn)物,黃色峰為內(nèi)標LIZ500,從左到右依次增大

四、討論

合理的抗生素治療和及時了解淋病患者的性傳播網(wǎng)絡(luò)是防治淋球菌感染的重要措施。研究報道,MLVA分型可用于研究菌株在不同地區(qū)的分布,以便確定某一地區(qū)菌株的型別特點及爆發(fā)的流行菌株型別[2];根據(jù)型別特點以確定菌株的進化及遺傳學特點[4];研究不同型別在人群的分布特征[5];也可根據(jù)菌株對藥物敏感性與菌株型別的關(guān)系,及早確定菌株型別與耐藥之間的關(guān)系[2]。

MLVA分型在1990年代開始用于炭疽桿菌、土拉熱桿菌、包柔螺旋體螺旋體、大腸桿菌、結(jié)核桿菌等病原體的分子流行病學研究。淋球菌MLVA分型根據(jù)FA1090淋球菌菌株整個基因組序列,采用Tandem Repeat Finder軟件篩選出合適的串聯(lián)重復(fù)序列,通過分析菌株串聯(lián)重復(fù)序列的數(shù)目來分型。有研究[6-10]已經(jīng)建立了結(jié)核分枝桿菌MLVA分型方法標準化操作。MLVA分型可采用基因測序、聚丙烯酰胺凝膠電泳、毛細管電泳3種實驗方法。前兩種實驗方法在文獻中已經(jīng)有報道用于MLVA分型[2-5]。毛細管電泳結(jié)果與聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果對比,具有一致性,說明毛細管電泳可用于MLVA分型。毛細管電泳是一種省時省力的實驗方法,與測序比較,價格便宜,PCR濃度要求低;與聚丙烯酰胺凝膠電泳比較,操作簡單,省時省力,有利于大樣本分子流行病學的研究。綜上所述,毛細管電泳是進行MLVA分型較好的實驗方法,但該實驗方法也有一定的局限性,例如引物需要避光保存,對500 bp以上VNTR準確性低。

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2014-02-20)

(本文編輯:吳曉初)

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.12.021

國家自然科學基金(81101294);國家十一五科技重大專項(2008ZX10001-005)

210042南京,中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院皮膚病研究所

尹躍平,Email:yinyp@ncstdlc.org