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淋球菌OmpA蛋白的克隆表達(dá)、保守性及抗原表位分析

黃健1，黃美容2，駱詩露3，肖質(zhì)會(huì)3，聶鑫3，閔迅1

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，貴州 遵義563099；2. 遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 輸血科，貴州 遵義563099；3.遵義醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，貴州 遵義563099)

[摘要]目的 了解OmpA蛋白在不同型別淋球菌間的保守性，分析OmpA蛋白的B細(xì)胞抗原表位，并通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲取其重組蛋白。方法 從Genebank數(shù)據(jù)庫中獲取不同型別淋球菌的OmpA蛋白氨基酸序列，利用ClustalX 2.1軟件對(duì)序列保守性進(jìn)行分析。利用DNASTAR軟件預(yù)測分析OmpA蛋白B細(xì)胞抗原表位。構(gòu)建ppSUMO-ompA重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)菌株中表達(dá)OmpA重組蛋白，以SDS-PAGE檢測表達(dá)的重組蛋白。結(jié)果 OmpA蛋白在不同型別淋球菌菌株間保守性高達(dá)99.6%，OmpA蛋白抗原表位可能位于28-37、78-86、95-102、147-154、159-165、201-208、213-218等氨基酸區(qū)段。SDS-PAGE檢測大腸桿菌中表達(dá)出OmpA蛋白，主要以包涵體形式存在。結(jié)論 成功構(gòu)建ppSUMO-ompA重組表達(dá)載體，獲得包涵體形式的OmpA蛋白，且OmpA蛋白可能是一種保守性較好的淋球菌蛋白疫苗候選分子。

[關(guān)鍵詞]淋球菌；OmpA蛋白；原核表達(dá)；保守性；抗原表位

淋球菌(Neisseria gonorrhoeae，NG)是淋病的唯一病原體，其主要引起泌尿生殖系統(tǒng)化膿性感染[1]。資料顯示，每年全球約有62 000 000新增淋病患者[2]。目前，淋球菌感染仍是嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全的一種重要的性傳播疾病。如何有效預(yù)防和控制淋病，成為全世界普遍關(guān)注的公共衛(wèi)生問題。目前，抗生素是治療其感染的主要手段，但隨著淋球菌耐藥菌株的廣泛出現(xiàn)及播散[3]，對(duì)其防治帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。近年研究顯示，保守的淋球菌疫苗能誘導(dǎo)殺菌性抗體的產(chǎn)生，從而能有效地清除淋球菌感染[4]。因此，積極發(fā)展有效的淋球菌疫苗將成為預(yù)防和控制淋病的重要手段。

OmpA(outer membrane protein A)是淋球菌的一種外膜蛋白質(zhì)，研究顯示其在粘附和入侵宮頸癌細(xì)胞和子宮內(nèi)膜細(xì)胞扮演了一個(gè)重要作用[5]。此外，在小鼠感染模型中，ompA基因敲除菌株與野生型菌株相比，其感染小鼠能力顯著降低[5]。提示OmpA蛋白是淋球菌致病過程中的重要毒力因子，可能是一種較好的蛋白疫苗候選靶點(diǎn)。因此，本研究擬首先對(duì)其保守性進(jìn)行分析，并對(duì)其B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行分析，最后通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲取其重組蛋白，從而為下一步以O(shè)mpA蛋白為基礎(chǔ)的疫苗研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1菌株及質(zhì)粒淋球菌ATCC49226標(biāo)準(zhǔn)菌株，大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)菌株，ppSUMO質(zhì)粒為本課題組保存。

1.2主要試劑PrimerStar高保真DNA聚合酶、DNA marker、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI、DNA片段純化試劑盒、蛋白質(zhì)分子量marker均購于大連TaKaRa公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、卡那霉素、LB培養(yǎng)基購于生工生物工程(上海)股份有限公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購于美國Omega公司；基因組DNA提取試劑盒購于北京天根公司。

1.3保守性分析本研究從Genebank數(shù)據(jù)庫中獲取不同型別淋球菌的OmpA蛋白氨基酸序列，以ClustalX 2.1軟件對(duì)序列保守性進(jìn)行分析。

1.4B細(xì)胞抗原表位預(yù)測利用DNASTAR Lasergene v7.1軟件基于Kyte-Doolittle法、Karplus-Schulz法、Jameson-Wolf法、Emini法，分別對(duì)OmpA蛋白親水性、可塑性、抗原指數(shù)、表面可能性進(jìn)行分析，以預(yù)測OmpA蛋白B細(xì)胞抗原表位。

1.5引物的設(shè)計(jì)及合成用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，上 游 引 物 F : 5'- GGAATTCATGACTTTCTTCAAACCCTC-3'(下劃線為EcoRI酶切位點(diǎn)); 下游引物R: 5'- CCGCTCGAGTTACATGTGCCGTGCGGCGTT-3'，(下劃線為XhoⅠ酶切位點(diǎn))，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.6ompA基因的擴(kuò)增用基因組DNA提取試劑盒提取淋球菌DNA，并以此為模板擴(kuò)增ompA基因，反應(yīng)體系為50 μL：ddH2O 32 μL、5×PS Buffer 10 μL、dNTP Mixture 4 μL、淋球菌模板DNA 1.5 μL、上游引物F和下游引物R各1 μL、Prime Star酶0.5 μL。PCR反應(yīng)條件:98 ℃ 20 s; 55 ℃ 15 s，72 ℃35 s，30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物按DNA純化試劑盒說明書進(jìn)行純化。

1.7ppSUMO-ompA重組質(zhì)粒的構(gòu)建、篩選及鑒定將ppSUMO質(zhì)粒和ompA基因片段用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI進(jìn)行雙酶切，酶切條件：37 ℃，6 h，然后行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。按摩爾比5∶1比例將質(zhì)粒和目的基因混合后，以T4 DNA連接酶16 ℃連接16 h。連接產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，鋪于含50μg/L卡那霉素的平板上篩選克隆。挑取單個(gè)克隆，行菌液PCR鑒定，陽性克隆過夜增菌后提取重組質(zhì)粒行雙酶切鑒定[6]。

1.8重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)將重組質(zhì)粒ppSUMO-ompA轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，挑選、鑒定陽性克隆后，接種于LB培養(yǎng)液(含50 μg/L卡那霉素)中，37 ℃培養(yǎng)至光密度A600=0.5～0.6時(shí)，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG，18 ℃誘導(dǎo)12 h，12 000×g離心10 min收集菌體，超聲破菌后SDS-PAGE鑒定蛋白表達(dá)形式。

2結(jié)果

2.1OmpA蛋白保守性分析從Genebank數(shù)據(jù)庫中獲得不同型別淋球菌OmpA蛋白氨基酸序列：NG 19(登錄號(hào)：EEZ46032.2)、NG MS11(登錄號(hào)：EEZ48208.2)、NG F62(登錄號(hào)：EFF40036.1)、NG NCCP11945(登錄號(hào)：ACF30492.1)、NG FA 1090(登錄號(hào)：AAW90192.1)、NG DGI2(登錄號(hào)：EFE04719.1)，對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示OmpA蛋白在不同型別菌株間保守性達(dá)99.6%。

圖1　不同型別淋球菌間OmpA蛋白保守性分析

2.2B細(xì)胞抗原表位分析從圖2可見，4種基于親水性、可塑性、抗原指數(shù)及表面可能性方法預(yù)測的OmpA蛋白B細(xì)胞抗原表位位置較為吻合，綜合結(jié)果顯示其較可能成為B細(xì)胞抗原表位的氨基酸區(qū)段為28-37、78-86、95-102、147-154、159-165、201-208、213-218。

圖2　OmpA蛋白B細(xì)胞抗原表位分析

2.3ompA基因擴(kuò)增ompA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，在675bp處可見單一條帶，其大小與預(yù)期相符(見圖3)。

M：DNA Marker；1-2：ompA基因擴(kuò)增產(chǎn)物。圖3　PCR擴(kuò)增omp A基因

2.4重組表達(dá)載體的構(gòu)建ompA基因擴(kuò)增產(chǎn)物克隆于ppSUMO質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，得到多個(gè)克隆，經(jīng)菌液PCR鑒定，第1、2、5、8、10、11、13號(hào)克隆為陽性克隆，其余克隆為假陽性(見圖4)。ppSUMO-ompA重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRI、XhoI雙酶切，可見675bp大小的酶切片段(見圖5)。

M：DNA Marker；1-13：不同克隆中ompA基因擴(kuò)增產(chǎn)物。圖4　菌液 PCR擴(kuò)增ompA基因

M:DNA Marker；1:ompA基因?qū)φ眨?:重組質(zhì)粒ppSUMO-ompA雙酶切產(chǎn)物。圖5　ppSUMO-ompA重組質(zhì)粒雙酶切鑒定

2.5重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)由圖6可見，表達(dá)菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后可見一條明顯增粗的蛋白條帶，其相對(duì)分子量約為39.4kD大小，即等于23.4kD大小 Omp A蛋白與16kD SUMO標(biāo)簽蛋白的分子量之和，與預(yù)期相符。對(duì)超聲破菌液分析顯示，OmpA蛋白主要位于破菌液沉淀中，表明該蛋白主要以包涵體形式表達(dá)(見圖6)。

M:蛋白質(zhì)分子量marker；1:未誘導(dǎo)的空載菌；2:未誘導(dǎo)的表達(dá)菌；3:誘導(dǎo)的表達(dá)菌；4:表達(dá)菌超聲破菌液；5:表達(dá)菌超聲破菌液沉淀；6:表達(dá)菌超聲破菌液上清。圖6　Omp A重組蛋白表達(dá)SDS-PAGE鑒定圖

3討論

蛋白質(zhì)疫苗以其具有保守性好、免疫原性好、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，將成為未來淋球菌疫苗研究的重要方向。篩選保守有效的蛋白質(zhì)疫苗對(duì)于未來淋球菌防治具有重要現(xiàn)實(shí)意義。目前，已發(fā)現(xiàn)一些蛋白質(zhì)疫苗可以誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生針對(duì)淋球菌的殺菌性抗體。如Por A蛋白誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生的抗體水平與血清抗菌活性直接相關(guān)，由于其免疫原性及保守性好，是目前較好的疫苗候選靶點(diǎn)[7]。另外，最近研究顯示NspA蛋白在小鼠模型中可以誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性殺菌抗體及有效的調(diào)理吞噬作用[8]。但目前總體來說，淋球菌蛋白疫苗靶點(diǎn)的篩選進(jìn)展還較緩慢，其中較為重要的原因是淋球菌可產(chǎn)生頻繁的抗原變異，這對(duì)于篩選保守的蛋白疫苗靶點(diǎn)帶來巨大挑戰(zhàn)；此外，由于有效的抗生素治療使得淋球菌疫苗研究投入減少[9]。但近年來的耐藥監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，目前已有淋病奈瑟菌對(duì)臨床使用的所有抗生素產(chǎn)生耐藥抵抗的報(bào)道，對(duì)其治療面臨無藥可用的危險(xiǎn)[10]。因此，積極篩選保守有效的蛋白質(zhì)疫苗對(duì)于未來淋球菌的防治有重要的理論與現(xiàn)實(shí)意義。

OmpA蛋白是淋球菌中的一種膜蛋白，在其致病過程中的發(fā)揮著重要作用。本研究首先對(duì)OmpA蛋白保守性進(jìn)行分析，顯示其在不同型別淋球菌間具有較高的保守性，提示其可能為較好的蛋白疫苗候選靶點(diǎn)。進(jìn)一步利用DNASTAR軟件對(duì)OmpA蛋白抗原表位分析，發(fā)現(xiàn)本研究選取的4種方法預(yù)測的抗原表位位置較為吻合，提示氨基酸區(qū)段28-37、78-86、95-102、147-154、159-165、201-208、213-218成為抗原表位的可靠性較大，這可為后續(xù)抗原表位鑒定奠定了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。為獲取以O(shè)mpA蛋白作為免疫原的蛋白疫苗，本研究通過原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)其蛋白進(jìn)行重組表達(dá)。我們構(gòu)建了ppSUMO-ompA重組質(zhì)粒，并在大腸桿菌中成功大量表達(dá)出OmpA蛋白。對(duì)蛋白表達(dá)形式分析顯示，其主要以包涵體形式表達(dá)。蛋白包涵體的形成受翻譯速率、折疊速率等因素影響，當(dāng)?shù)鞍椎姆g速率遠(yuǎn)大于折疊速率時(shí)，就容易導(dǎo)致產(chǎn)生錯(cuò)誤折疊的空間構(gòu)象而導(dǎo)致包涵體形成[8]。而重組蛋白表達(dá)過程中翻譯速率、折疊速率又受多種因素的影響，如誘導(dǎo)劑濃度、搖床的轉(zhuǎn)速、誘導(dǎo)溫度等[11]。本研究分別采用不同誘導(dǎo)時(shí)間、不同誘導(dǎo)劑濃度、不同轉(zhuǎn)速等表達(dá)條件，但均未獲得以可溶形式表達(dá)的OmpA蛋白，這可能與載體在宿主表達(dá)菌株中的高水平表達(dá)有關(guān)。包涵體的致密結(jié)構(gòu)可以形成空間屏障，阻止蛋白酶的水解作用，有利于重組蛋白的保留，且通過合適的變性復(fù)性條件，在多數(shù)條件下可以從包涵體中獲得純度達(dá)90%以上的重組蛋白[12]。因此，在下一步工作中，我們擬對(duì)包涵體進(jìn)行純化、變性、復(fù)性，以期獲得純度較好的可溶性免疫原，用于后續(xù)蛋白疫苗研究。

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[收稿2015-05-06;修回2015-05-26]

(編輯：王福軍)

臨床醫(yī)學(xué)研究

Clone and expression of OmpA protein from Neisseria gonorrhoeae and analysis of its conservation and B cell epitopes

HuangJian1,HuangMeirong2,LuoShilu3,XiaoZhihui3,NiXin3,MinXun1

(1.Department of Laboratory Medicine，Zunyi Guizhou 563099,China;2.Department of Blood Transfusion,The Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China;3.Department of Laboratory Medicine ,Zunyi Medical University，Zunyi Guizhou 563099，China)

[Abstract]Objective To understand the conservation of OmpA protein among different , and to analyze the B cell antigen epitope of OmpA protein, and expression OmpA protein in E.coli. Methods Amino acid sequences of OmpA protein in different types of Neisseria gonorrhoeae were obtained from the Genebank database,The sequence conservation of OmpA proteins were analyzed using ClustalX 2.1 software. B cell antigen epitope of OmpA protein were predictively analyzed by DNASTAR software. Recombinant expression vector ppSUMO-ompA was constructed and identified. OmpA protein was expressed in E.coli BL21 (DE3) strains and recombinant proteins were analyzed by SDS-PAGE.Results The conservation of OmpA proteins among different types of Neisseria gonorrhoeae strain was up to 99.6%. The most possible epitopes of OmpA protein were located within or nearby its N-terminal NO.78-86, 28-37, 147-154, 159-165, 201-208, and 213-218. OmpA protein was successfully expressed in E. coli, and it mainly exists in the form of the inclusion body.Conclusion Recombinant expression vector ppSUMO-ompA was successfully constructed and inclusion bodies of OmpA protein were obtained. OmpA protein may be a good conservative vaccine candidate targets of Neisseria gonorrhoeae.

[Key words]neisseria gonorrhoeae;ompA protein;prokaryotic expression; conservative; antigen epitope

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼][中圖法分類號(hào)] R378.1 A

[文章編號(hào)]1000-2715(2015)03-0261-05

[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NO：81460317)；貴州省科技廳資助項(xiàng)目(NO:2012GZ80958);遵義市科技局與遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院聯(lián)合基金(NO：遵義市科合社字[2014]72)。[通信作者]閔迅，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：細(xì)菌致病分子機(jī)制研究，E-mail:2815400619@qq.com。