栗小英等

摘要：病程相關(guān)蛋白1（pathogenesis-related proteins1，PR1）是一類(lèi)以基因家族形式存在的重要病程相關(guān)蛋白，在前期研究中，在小麥抗葉銹病近等基因系材料TaLr35中成功獲得了1個(gè)小麥病程相關(guān)蛋白1基因TaLr35PR1，具有植物防御體系中的SCP保守結(jié)構(gòu)域。利用生物信息學(xué)方法進(jìn)一步明確，該基因含有信號(hào)肽，定位于細(xì)胞間隙，可能含有跨膜結(jié)構(gòu)域，相對(duì)分子量為17.3 ku，與多個(gè)植物病程相關(guān)蛋白1序列具有較高同源性；利用半定量RT-PCR方法結(jié)合genetools、SPSS軟件分析TaLr35PR1基因表達(dá)模式，結(jié)果表明，信號(hào)分子水楊酸（salicylic acid，SA）、脫落酸（abscisic acid，ABA）明顯誘導(dǎo)該基因表達(dá)，且用信號(hào)分子預(yù)處理后接種葉銹菌，基因表達(dá)量明顯增加；構(gòu)建了TaLr35PR1基因的原核表達(dá)載體pEASY-PR1，在大腸桿菌中高效表達(dá)分子量約為17 ku的融合蛋白，明確其最佳誘導(dǎo)條件為在 0.8 mmol/L IPTG下于25 ℃誘導(dǎo)8 h。

關(guān)鍵詞：葉銹菌；信號(hào)分子；病程相關(guān)蛋白1；表達(dá)分析；原核表達(dá)

中圖分類(lèi)號(hào)： Q756文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）09-0028-04

收稿日期：2014-08-27

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（編號(hào)：2013CB127700）；河北省自然科學(xué)基金（編號(hào)：C2012204005）。

作者簡(jiǎn)介：栗小英（1988—），女，河北張家口人，碩士研究生，研究方向?yàn)榉肿又参锊±怼-mail：506112516@163.com。

通信作者：王海燕，副教授，主要從事分子植物病理學(xué)研究。E-mail：ndwanghaiyan@163.com。植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，為了抵抗病害對(duì)自身生長(zhǎng)的不良影響，在一定程度上發(fā)展了感受生物脅迫信號(hào)的機(jī)制，通過(guò)體內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，激發(fā)轉(zhuǎn)錄因子與相應(yīng)的順式作用元件的結(jié)合，進(jìn)而啟動(dòng)特定基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，最后導(dǎo)致植物對(duì)脅迫作出反應(yīng)[1]。病程相關(guān)（pathogenesis-related，PR）蛋白質(zhì)在信號(hào)傳遞與脅迫應(yīng)答中起調(diào)節(jié)作用。PR 基因的最初發(fā)現(xiàn)主要是由于它們?cè)谥参锸艿讲≡锴秩緯r(shí)會(huì)大量表達(dá)。PR蛋白質(zhì)除了在抗病反應(yīng)中發(fā)揮重要作用外，在植物抗衰老、傷害、非生物逆境脅迫和激素處理，以及正常生長(zhǎng)中也發(fā)揮重要作用。在PR蛋白家族中，PR1是一類(lèi)重要的蛋白，但對(duì)其作用機(jī)制以及靶物質(zhì)還尚不了解[2]。水楊酸（salicylic acid，SA）或乙烯（ethylene） 可誘導(dǎo)PR1基因的表達(dá)，常被作為系統(tǒng)獲得性抗性（systemic acquired resistance，SAR）的分子標(biāo)記[3]，因此，PR1基因編碼的蛋白質(zhì)成為目前的研究熱點(diǎn)。

PR1蛋白最早從煙草中發(fā)現(xiàn)，隨后從許多單子葉和雙子葉植物中鑒定出PR1基因。PR1是一類(lèi)可經(jīng)病原菌和SA大量誘導(dǎo)表達(dá)的PR蛋白，蛋白分子量為14～17 ku，有酸性和堿性，大多呈堿性。PR1 被證實(shí)具有抗病毒擴(kuò)散、限制真菌入侵和保護(hù)植物抵御逆境脅迫等功能[4-5]。Agrawal 等研究證明OsPR1a、OsPR1b基因受茉莉酸（jasmonic acid，JA）、SA、過(guò)氧化氫（H2O2）、蛋白酶抑制劑斑蝥素（cantharidin，CN）、草藻滅（endothall，EN）和稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）的誘導(dǎo)，對(duì)光傷害及磷酸酶抑制劑等環(huán)境脅迫和化學(xué)處理作出反應(yīng)[6-8]。楊德翠等研究發(fā)現(xiàn)，PR1基因表達(dá)量與水楊酸的積累密切相關(guān)，表達(dá)量的升高增強(qiáng)了牡丹對(duì)柱枝孢葉斑?。–ylindrocladium canadense）的抗性，并且發(fā)現(xiàn)該病侵染牡丹 24 h 后，PR1基因的表達(dá)顯著提高[9]。

小麥（Triticum aestivum）是重要的糧食作物，是全世界一半以上人口的主糧。小麥生產(chǎn)經(jīng)常受到病蟲(chóng)害的威脅，尤其由小麥葉銹菌（Puccinia triticina）引起的小麥葉銹病是威脅全球小麥穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的主要病害之一。小麥抗葉銹病基因Lr35，其抗性從2葉期開(kāi)始表達(dá)，6葉期完全表達(dá)，是1個(gè)十分有效的成株抗葉銹病基因。筆者前期利用RT-PCR和cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)（rapid amplification of cDNA ends，RACE）技術(shù)從含有小麥抗葉銹病基因Lr35的近等基因系材料TcLr35中獲得1個(gè)PR1基因的cDNA全長(zhǎng)，命名為T(mén)aLr35PR1[10]。本研究擬利用半定量RT-PCR明確TaLr35PR1基因在受葉銹菌和信號(hào)分子誘導(dǎo)后核酸水平的表達(dá)特征，為進(jìn)一步探究其在生物與非生物脅迫過(guò)程中的功能及了解生物脅迫應(yīng)答機(jī)理提供線索。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試植物材料為攜帶小麥抗葉銹病基因Lr35的回交6代近等基因系材料TcLr35，及與其遺傳背景相同的感病親本“Thatcher”；供試小麥葉銹菌菌株為07-10-426-1（PHNT），該菌株對(duì)TcLr35呈非親和反應(yīng)（反應(yīng)型為1型），對(duì)Thatcher呈親和反應(yīng)（反應(yīng)型為4型）。各種限制性內(nèi)切酶、質(zhì)粒、膠回收試劑盒、Taq DNA聚合酶購(gòu)自生工生物工程上海（股份）有限公司；原核表達(dá)載體pEASYTM-E1購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

化學(xué)試劑處理：參考Zambounis等的方法[11]配制50 μmol/L SA溶液、50 μmol/L ABA溶液，噴灑于六葉期的成株小麥葉片表面至溶液滴下，于18～25 ℃、光照時(shí)間10～14 h的溫室培養(yǎng)，處理3 d后，開(kāi)始接種葉銹菌07-10-426-1（孢子萌發(fā)率為80%以上），以未接菌處理為對(duì)照，分別在接種后0、6、12、24、36、48、72、120 h取0.1 g葉片，液氮速凍后于-80 ℃儲(chǔ)藏備用。

1.3總RNA的提取和cDNA第1鏈的合成

采用Bio-Flux公司的BIOZOL試劑盒提取小麥各處理樣品總RNA，按照寶生物工程（大連）有限公司的反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA第1鏈。反轉(zhuǎn)錄合成的模板直接用于PR1基因的半定量RT-PCR分析。

1.4小麥TaLr35PR1生物信息學(xué)分析

利用SignalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）、TMHMM（http：//www.hsls.pitt.edu/obrc/index.）、ProtScale（http：//expasy.org/tools/）和Spidey（http：//www. nebi. nlm. nih. Gov/spidey）在線工具完成對(duì)基因結(jié)構(gòu)模式的分析。分別利用SOPMA程序和Phyre2在線工具完成對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。

1.5小麥TaLr35PR1基因表達(dá)模式分析

根據(jù)TaLr35PR1基因開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF）設(shè)計(jì)特異引物TaLr35PR1-F、TaLr35PR1-R（TaLr35PR1-F：5′- CCCAAGCTTTTAGTATGGTTTCTGTCCAATGAT-3′；TaLr35PR1-R：5′-CGCGGATCCAACTCGCCTCAGGACTAC-3′），以小麥中組成型表達(dá)的基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）基因（GenBank登錄號(hào)：AF251217；GAPDH-F：5′-AACTGCCTTGCTCCTCTTGC-3′；GAPDH-R：5′-CTGTTGTCACCCTGGAAGTCA-3′）作為內(nèi)標(biāo)基因。以葉銹菌、ABA，SA處理后不同時(shí)間點(diǎn)的小麥葉片的cDNA為模板進(jìn)行半定量RT-PCR。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃變性30 s，51 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)genetools軟件得出表達(dá)量大小，利用SPSS軟件計(jì)算方差和顯著性，綜合進(jìn)行分析，獲得TaLr35PR1基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.6小麥TaLr35PR1原核表達(dá)載體的構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá)

設(shè)計(jì)原核表達(dá)特異引物YTaLr35PR1-F：5′-CGCGGATCCAACTCGCCTCAGGACTAC-3′、YTaLr35PR1-R：5′-CCCAAGCTTTTAGTATGGTTTCTGTCCAATGAT-3′；PCR產(chǎn)物與表達(dá)載體pEASY-E1進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化。首先使用PCR擴(kuò)增用引物驗(yàn)證目的片段與載體連接是否成功，再利用上游引物YTaLr35PR1-F和載體自帶T7終止子引物T7terminator（5′-TAGTTATTGCTCAGCGGTGG-3′）驗(yàn)證目的片段插入的方向性，然后轉(zhuǎn)入表達(dá)載體BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

2結(jié)果與分析

2.1小麥TaLr35PR1基因特征分析

ProtScale軟件[12]預(yù)測(cè)TaLr35PR1編碼的蛋白總體表現(xiàn)為疏水性；SignalP 4.1[13]預(yù)測(cè)TaLr35PR1氨基酸序列具有信號(hào)肽，信號(hào)肽酶切位點(diǎn)在第1～24個(gè)氨基酸殘基之間。利用 SMART在線軟件對(duì)TaLr35PR1基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明該基因具有保守的抗真菌結(jié)構(gòu)域SCP（圖1）；利用Phyre2軟件分析，結(jié)果表明該基因由4條α螺旋、4條β折疊構(gòu)成，呈三明治般的ɑβɑ結(jié)構(gòu)。

2.2小麥TaLr35PR1基因表達(dá)模式

2.2.1SA誘導(dǎo)葉片中TaLr35PR1基因的表達(dá)譜分析50 μmol/L SA脅迫處理后，TaLr35PR1基因表達(dá)量在處理 12 h 明顯增加，并達(dá)到最大，約為對(duì)照組（0 h）表達(dá)量的7.6倍；之后隨著時(shí)間延長(zhǎng)，表達(dá)量減少，到120 h又略有增加，約為對(duì)照組（0 h）表達(dá)量的2.6倍（圖2）。為了明確信號(hào)分子與葉銹菌的協(xié)調(diào)作用，50 μmol/L水楊酸脅迫處理3 d后，再接種葉銹菌，TaLr35PR1基因表達(dá)量在接種12 h極顯著增加并達(dá)到最大（P<0.01），約為對(duì)照組（0 h）的2.6倍；之后隨著接種時(shí)間延長(zhǎng)，表達(dá)量顯著減少，到120 h又略有增加，約為未接種對(duì)照組（0 h）表達(dá)量的1.8倍。水楊酸預(yù)處理后再接種葉銹菌的表達(dá)趨勢(shì)與未接菌處理基本一致，但整體表達(dá)水平高于未接菌處理，接菌0 h后，TaLr35PR1基因表達(dá)量約為未接菌處理5.9倍。上述結(jié)果均扣除了Thatcher的表達(dá)量。

2.2.2ABA誘導(dǎo)葉片中TaLr35PR1基因的表達(dá)譜分析50 μmol/L ABA脅迫處理后，TaLr35PR1基因表達(dá)量在處理 12 h 明顯增加，72 h達(dá)到表達(dá)高峰，約為對(duì)照組（0 h）表達(dá)量的3.6倍，至120 h表達(dá)量減少（圖3）。為了明確信號(hào)分子與葉銹菌的協(xié)調(diào)作用，在50 μmol/L脫落酸脅迫預(yù)處理后，再接種葉銹菌。結(jié)果表明，TaLr35PR1基因表達(dá)量在接種12 h后顯著增加，至72 h達(dá)到最大（P<0.05），約為未接種對(duì)照組（0 h）的1.8倍；之后隨著接種時(shí)間延長(zhǎng)，表達(dá)量稍有減少，整體表達(dá)趨勢(shì)與未接菌處理一致，但表達(dá)量明顯高于未接菌處理；接菌0 h后，TaLr35PR1基因表達(dá)量約為脫落酸處理（0 h）的3.2倍。上述結(jié)果均扣除了Thatcher的表達(dá)量。

2.3TaLr35PR1基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建

利用pEASY-E1表達(dá)試劑盒構(gòu)建表達(dá)載體TaLr35PR1-pEASY，為驗(yàn)證目的片段是否與載體成功連接，利用YTaLr35PR1-F、YTaLr35PR1-R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)重組子進(jìn)行初篩，獲得約420 bp左右的片段，與該引物對(duì)TcLr35總RNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小一致，說(shuō)明目的基因已經(jīng)整合到pEASY-E1載體上。為驗(yàn)證目的片段插入載體的方向是否正確，使用YTaLr35PR1-F、T7terminator重組引物對(duì)重組子進(jìn)行篩選，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物為目的片段與載體序列的重組片段，獲得約500 bp左右的片段（圖4），證明插入載體的方向正確。測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步表明，目的片段插入表達(dá)載體的位置和讀碼框正確。

2.4TaLr35PR1基因的體外誘導(dǎo)表達(dá)

以不同溫度、不同IPTG濃度、不同時(shí)間誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化了表達(dá)載體pEASY-PR1的大腸桿菌BL21（DE3）。經(jīng)SDS-PAGE

分析可見(jiàn)，在25 ℃溫度下，誘導(dǎo)的pEASY-PR1在17 ku左右產(chǎn)生1條新的誘導(dǎo)條帶，大小與理論值推算相符，而在27 ℃溫度下未見(jiàn)明顯誘導(dǎo)條帶（圖5-A）；以未經(jīng)誘導(dǎo)的pEASY-PR1為對(duì)照，0.01～0.80 mmol/L IPTG誘導(dǎo)菌體均產(chǎn)生1條約17 ku的新條帶，確定0.80 mmol/L IPTG為最佳的誘導(dǎo)濃度（圖5-B）；隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，誘導(dǎo)2 h蛋白表達(dá)量增加明顯，6 h至過(guò)夜趨于穩(wěn)定，最佳誘導(dǎo)時(shí)間為8 h（圖5-C）。結(jié)果表明，小麥TaLr35PR1基因在大腸桿菌中得到了高效表達(dá)，獲得了分子量約為17 ku的融合蛋白，最佳誘導(dǎo)條件為在0.8 mmol/L IPTG下于25 ℃誘導(dǎo)8 h。

3結(jié)論與討論

有報(bào)道證明擬南芥在抵抗病原物后的茉莉酸（JA）、SA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)協(xié)調(diào)擬南芥抗病性[14]。此外，在病原物侵染前用SA處理擬南芥，發(fā)現(xiàn)可以誘導(dǎo)SAR反應(yīng)以及PR蛋白的表達(dá)，以增強(qiáng)抗病能力[15]。PR1基因能被病菌侵染和信號(hào)分子脅迫所誘導(dǎo)[16-17]，PR1基因的表達(dá)增強(qiáng)了植物抵御病害和其他各種脅迫的能力。機(jī)械損傷、植物激素（JA、SA、ET）、蛋白磷酸酶抑制劑斑蝥素（CN）、草藻滅（EN）都能誘導(dǎo)水稻OsPR1a基因的表達(dá)[18]。SA介導(dǎo)的SAR反應(yīng)主要對(duì)活體營(yíng)養(yǎng)型病菌起作用，而JA/ET介導(dǎo)的抗病信號(hào)途徑對(duì)抵抗腐生型真菌侵染起到作用[19]。棉花的PR3、PR10、GST18基因在轉(zhuǎn)錄水平上不僅受JA、SA的誘導(dǎo)，而且受棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum）誘導(dǎo)后表達(dá)水平顯著上調(diào)[11]。小麥葉銹菌為典型的活體營(yíng)養(yǎng)型病菌。本研究旨在明確SA和葉銹菌誘導(dǎo)對(duì)TaLr35PR1基因表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TaLr35PR1基因表達(dá)受SA單獨(dú)誘導(dǎo)；同時(shí)，在SA脅迫處理后再接種葉銹菌，TaLr35PR1基因表達(dá)趨勢(shì)與SA誘導(dǎo)表達(dá)趨勢(shì)一致，而且SA與葉銹菌協(xié)同作用顯著增加了TaLr35PR1表達(dá)量，且其表達(dá)量明顯高于葉銹菌單獨(dú)誘導(dǎo)。

ABA是調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育的一種激素。當(dāng)植物面臨不利的自然環(huán)境時(shí)，植物體內(nèi)ABA的含量會(huì)增加，進(jìn)而促進(jìn)植物生長(zhǎng)。植物體內(nèi)存在ABA、非ABA 2種調(diào)節(jié)系統(tǒng)[20]。實(shí)現(xiàn)這種調(diào)節(jié)必須能夠順利完成從刺激到準(zhǔn)確反應(yīng)的一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，這主要包括以受體為中心的脫落酸信號(hào)的細(xì)胞識(shí)別、以第二信使為中心的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)換，以及以蛋白磷酸化為中心的信號(hào)放大與傳導(dǎo)等過(guò)程[14]。在前期研究中證明ABA可以誘導(dǎo)病程相關(guān)蛋白的表達(dá)[21]，在本研究中發(fā)現(xiàn)TaLr35PR1基因表達(dá)受ABA誘導(dǎo)，而且脫落酸與葉銹菌協(xié)同作用明顯誘導(dǎo)TaLr35PR1基因的表達(dá)，而且表達(dá)量顯著高于SA和葉銹菌單獨(dú)誘導(dǎo)?；?種信號(hào)分子對(duì)TaLr35PR1基因的誘導(dǎo)表達(dá)模式，推測(cè)小麥TaLr35PR1基因在參與小麥抗葉銹病防御反應(yīng)時(shí)，可能通過(guò)SA、ABA 2種信號(hào)途徑，但具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步探討。

水稻、小麥等作物中關(guān)于病程相關(guān)蛋白從蛋白水平驗(yàn)證抗病性的研究報(bào)道較多。李雪姣等研究發(fā)現(xiàn)，在水稻與白葉枯病菌互作時(shí)，病程相關(guān)蛋白1家族在接菌后不同時(shí)間點(diǎn)、不同生長(zhǎng)期都發(fā)揮作用[22]；關(guān)明俐等的研究有力地證明了不同的病程相關(guān)蛋白在水稻與白葉枯病菌互作時(shí)發(fā)揮作用[23]；此外，牛吉山等應(yīng)用RT-PCR和cDNA文庫(kù)篩選技術(shù)，從抗白粉病小麥-簇毛麥6VS/6AL易位系中分離到1個(gè)小麥類(lèi)甜蛋白基因的全長(zhǎng)cDNA，Western分析表明其可能與小麥 6VS/6AL 易位系的抗白粉病性相關(guān)[24]；余宇克隆得到了小麥類(lèi)甜蛋白基因的全長(zhǎng)序列，并利用原核表達(dá)得到純度較高的類(lèi)甜蛋白[25]。后續(xù)研究將進(jìn)一步制備單克隆抗體，從蛋白水平分析其表達(dá)模式，并分析其他信號(hào)分子對(duì)該基因的影響，探析信號(hào)傳遞途徑。

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