張國嘉等

摘要：SOS2（SaltOverlySensitive2）是植物中一類耐鹽相關(guān)基因的統(tǒng)稱，在植物對鹽害的響應(yīng)及適應(yīng)過程中具有重要作用。本試驗以花生AhSOS2基因全長cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得AhSOS2的蛋白編碼區(qū)，將該區(qū)段與表達(dá)載體pET-28a（+）融合，構(gòu)建獲得原核表達(dá)載體pET-28a-AhSOS2，并進(jìn)一步在大腸桿菌BL21（DE3）中進(jìn)行表達(dá)。經(jīng)1.0mmol/LIPTG誘導(dǎo)后，獲得一條約51kD的融合蛋白條帶，且隨著IPTG誘導(dǎo)時間的延長，蛋白表達(dá)量逐漸提高，誘導(dǎo)8h可獲得較高的蛋白表達(dá)水平。

關(guān)鍵詞：花生；AhSOS2；原核表達(dá)；融合蛋白

中圖分類號：Q788文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2014）01-0006-04

花生（ArachishypogaeaL.）是重要的油料兼經(jīng)濟(jì)作物，我國花生總產(chǎn)居油料作物首位，種植面積居第二位[1]?；ㄉL過程中經(jīng)常受到生物或非生物脅迫的影響[2]。其中高鹽脅迫是嚴(yán)重危害植物生長發(fā)育的非生物脅迫因子之一，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成極大的負(fù)面影響[3，4]。在受到高鹽脅迫時，植物體內(nèi)離子平衡遭到破壞，但在長期的進(jìn)化過程中植物體也形成了一系列防御機(jī)制。其中SOS信號途徑是調(diào)節(jié)離子穩(wěn)態(tài)和提高植物耐鈉性的重要途徑之一[2]。

近年來，國內(nèi)外對SOS基因家族的研究越來越多，其中SOS1、SOS2、SOS3基因等都已進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研究，對轉(zhuǎn)基因擬南芥[5]、蘋果[6]、甘藍(lán)[7]等材料的研究結(jié)果均證明該家族基因在提高轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽性方面具有一定作用。SOS2是SOS途徑中一類關(guān)鍵抗逆相關(guān)基因，擬南芥中的研究結(jié)果顯示其在耐鹽、抗逆過程中具有重要作用[8]。

前人關(guān)于SOS2基因的研究多集中在分子水平上，雖然對部分SOS2基因編碼蛋白的分子量進(jìn)行了預(yù)測，但關(guān)于基因原核表達(dá)及表達(dá)條件優(yōu)化的報道較少。前期工作中，克隆到花生SOS2基因AhSOS2，大小約1462bp，編碼一個含446個氨基酸的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，預(yù)測該蛋白激酶分子量為51ku[9]。本研究將AhSOS2基因編碼區(qū)與原核表達(dá)載體pET-28a（+）融合，獲得pET-28a-AhSOS2，測序正確后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)中，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，最終獲得蛋白表達(dá)產(chǎn)物，為進(jìn)一步研究該基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

大腸桿菌DH5α及BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA凝膠回收試劑盒、限制性內(nèi)切酶及T4DNA連接酶均購自TaKaRa公司；高純質(zhì)?；厥赵噭┖匈徸员本┌偬┛松锛夹g(shù)有限公司；引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；序列測定由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心測序室完成。

1.2AhSOS2基因的擴(kuò)增

以AhSOS2基因的全長cDNA序列為模板，以AhSOS2EcoRⅠ1（5′CGGAATTCATGAAGAAGGTGAGGAATAAGATCG3′）和AhSOS2SalⅠ2（5′-GCGTCGACTACAGTCATTTGTCGAAGCATACC3′）（下劃線分別為EcoRⅠ和SalⅠ酶切位點）為引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得AhSOS2基因蛋白編碼區(qū)。PCR反應(yīng)體系（20μl）為：PCRmix10μl、10μmol/L上、下游引物各0.5μl、質(zhì)粒0.1μl、ddH2O補(bǔ)齊。反應(yīng)程序如下：94℃3min；94℃30s，56℃1.5min，72℃30s，35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。

1.3AhSOS2原核表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

PCR產(chǎn)物及原核表達(dá)載體pET-28a（+）分別經(jīng)EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切，回收酶切片段并純化，用T4DNA連接酶16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆進(jìn)行酶切鑒定，并送山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心測序室進(jìn)行測序，最終獲得重組表達(dá)載體pET-28a-AhSOS2。

將測序正確的pET-28a-AhSOS2轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)50μg/ml的Kan篩選及PCR鑒定，獲得陽性克隆。

1.4AhSOS2基因的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE檢測

將含有重組質(zhì)粒pET-28a-AhSOS2的BL21（DE3）陽性克隆振蕩培養(yǎng)，菌液以1∶100比例稀釋于預(yù)熱的抗性LB培養(yǎng)液中，培養(yǎng)至OD600值約為0.6后，加入IPTG至終濃度為1.0mmol/L，25℃、200r/min條件下，分別誘導(dǎo)0、2、4、6、8、10和12h。收獲菌液經(jīng)等量還原性2×SDS樣品緩沖液裂解，12%SDS-PAGE電泳，染色后凝膠成像儀上鑒定并照相。

2結(jié)果與分析

2.1AhSOS2基因擴(kuò)增

經(jīng)PCR擴(kuò)增，獲得一條約1350bp的條帶，與預(yù)測條帶大小一致（圖1）。

2.3融合蛋白的SDS-PAGE鑒定

如圖5，在25℃下，含有pET-28a-AhSOS2的BL21（DE3）菌體經(jīng)1.0mmol/LIPTG誘導(dǎo)2h后即可得到明顯的誘導(dǎo)帶，大小約51kD，與預(yù)期大小一致，表明AhSOS2基因可在原核系統(tǒng)中表達(dá)并獲得誘導(dǎo)產(chǎn)物。且隨誘導(dǎo)時間的延長，AhSOS2蛋白表達(dá)量逐漸提高，誘導(dǎo)8h，蛋白表達(dá)豐度達(dá)到較高水平，之后隨誘導(dǎo)時間的延長略有提高。

3結(jié)論與討論

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是外源基因表達(dá)中最成熟、應(yīng)用最廣泛的原核表達(dá)系統(tǒng)[10]，與其它表達(dá)系統(tǒng)相比，該系統(tǒng)有諸多優(yōu)點，如遺傳背景和生化特性非常清楚、操作簡便、成本低、周期短、表達(dá)蛋白可大量生產(chǎn)且易于純化等[11]。BL21是目前應(yīng)用最廣的宿主菌，IPTG在其蛋白表達(dá)中起著十分重要的作用。加入IPTG后可使阻遏蛋白不能與操縱基因結(jié)合，從而使外源基因大量轉(zhuǎn)錄，達(dá)到高效表達(dá)的效果[12]。不同的基因因生化特征及表達(dá)蛋白特性不同，其原核表達(dá)特點也不同。張傳義等[13]對蘋果AFL1基因進(jìn)行原核表達(dá)時，雖然外源施加IPTG能夠誘導(dǎo)AFL1蛋白的表達(dá)，但蛋白表達(dá)量不隨誘導(dǎo)時間的延長而改變。李靜等[14]在研究擬南芥AtCOR15a抗寒基因的原核表達(dá)時發(fā)現(xiàn)，加入IPTG誘導(dǎo)5h，蛋白表達(dá)達(dá)到較高水平，進(jìn)一步誘導(dǎo)至8h，蛋白表達(dá)量則有所降低。

SOS2是一類公認(rèn)的抗逆相關(guān)基因，在不同物種中關(guān)于其生理及功能的研究較多，但原核表達(dá)的研究則相對較少。本研究以前期試驗中獲得的AhSOS2基因全長cDNA為模板，通過特異性引物，獲得了AhSOS2基因的蛋白編碼區(qū)。在此基礎(chǔ)上，利用pET系列載體，構(gòu)建了AhSOS2基因的原核表達(dá)載體pET-28a-AhSOS2，經(jīng)酶切鑒定及測序正確后，將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)中。經(jīng)誘導(dǎo)及條件優(yōu)化，最終實現(xiàn)了AhSOS2基因在大腸桿菌中的成功表達(dá)。且隨誘導(dǎo)時間的延長，蛋白表達(dá)量提高，1mmol/LIPTG誘導(dǎo)8h，蛋白表達(dá)豐度達(dá)到較高水平，之后隨誘導(dǎo)時間的延長蛋白表達(dá)量略有提高。本試驗結(jié)果為進(jìn)一步研究AhSOS2基因及編碼蛋白的理化性質(zhì)、表達(dá)調(diào)控機(jī)制、空間結(jié)構(gòu)及制備特異性抗體等奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]湯松，禹山林，廖伯壽，等.我國花生產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀、存在問題及發(fā)展對策[J].花生學(xué)報，2010，39（3）：35-38.

[2]邵鳳霞.花生NAC轉(zhuǎn)錄因子的克隆和功能分析[D].濟(jì)南：山東師范大學(xué)，2009.

[3]ApseMP，AharonGS，SneddenWA，etal.Salttoleranceconferredbyover-expressionofavacuolarNa+/H+antiporterinArabidopsis[J].Science，1999，285：1256-1258.

[4]ZhuJK.Plantsalttolerance[J].TrendsPlantSci.，2001，6（2）：66-71.

[5]FujiiH，ZhuJK.AnautophosphorylationsiteoftheproteinkinaseSOS2isimportantforsalttoleranceinArabidopsis[J].MolecularPlant，2009，2：183-190.

[6]HuDG，LiM，LuoH，etal.MolecularcloningandfunctionalcharacterizationofMdSOS2revealsitsinvolvementinsalttoleranceinapplecallusandArabidopsis[J].PlantCell，2012，31：713-722.

[7]KushwahaHR，KumarG，VermaPK，etal.AnalysisofasalinityinducedBjSOS3proteinfromBrassicaindicateittobestructurallyandfunctionallyrelatedtoitsorthologfromArabidopsis[J].PlantPhysiologyandBiochemistry.2011，49（9）：996-1004.

[8]ZhuJK，LiuJ，XiongL.GeneticanalysisofsalttoleranceinArabidopsisthaliana：evidenceofacriticalroleforpotassiumnutrition[J].PlantCell，1998，10：1181-1192.

[9]LiuJ，IshitaniM，HalfterU.TheArabidopsisthalianaSOS2geneencodesaproteinkinasethatisrequiredforsalttolerance[J].Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97（7）：3730-3734.

[10]戴漢川，張曉偉，龍良啟，等.鴨leptin基因在大腸桿菌中的融合表達(dá)及生物學(xué)活性分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，40（11）：2615-2620.

[11]羅文新，張軍，楊海杰，等.一種帶增強(qiáng)子的原核高效表達(dá)載體的構(gòu)建及初步應(yīng)用[J].生物工程學(xué)報，2000，16（5）：578-581.

[12]PatnaikPR.Investigationkrinductioneffectonthesteadystateperformanceofacontinuousforrecombinantβ-galactosidase[J].ProcessBiochemistry，2001，36（11）：1069-1074.

[13]張傳義，孟玉平，孫海峰，等.蘋果AFL1基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在大腸桿菌中的表達(dá)[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（7）：14-16.

[14]李靜，李曉榮，王冬梅，等.擬南芥AtCOR15a抗寒基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及蛋白表達(dá)[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，47（10）：2031-2036.

SOS2是一類公認(rèn)的抗逆相關(guān)基因，在不同物種中關(guān)于其生理及功能的研究較多，但原核表達(dá)的研究則相對較少。本研究以前期試驗中獲得的AhSOS2基因全長cDNA為模板，通過特異性引物，獲得了AhSOS2基因的蛋白編碼區(qū)。在此基礎(chǔ)上，利用pET系列載體，構(gòu)建了AhSOS2基因的原核表達(dá)載體pET-28a-AhSOS2，經(jīng)酶切鑒定及測序正確后，將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)中。經(jīng)誘導(dǎo)及條件優(yōu)化，最終實現(xiàn)了AhSOS2基因在大腸桿菌中的成功表達(dá)。且隨誘導(dǎo)時間的延長，蛋白表達(dá)量提高，1mmol/LIPTG誘導(dǎo)8h，蛋白表達(dá)豐度達(dá)到較高水平，之后隨誘導(dǎo)時間的延長蛋白表達(dá)量略有提高。本試驗結(jié)果為進(jìn)一步研究AhSOS2基因及編碼蛋白的理化性質(zhì)、表達(dá)調(diào)控機(jī)制、空間結(jié)構(gòu)及制備特異性抗體等奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]湯松，禹山林，廖伯壽，等.我國花生產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀、存在問題及發(fā)展對策[J].花生學(xué)報，2010，39（3）：35-38.

[2]邵鳳霞.花生NAC轉(zhuǎn)錄因子的克隆和功能分析[D].濟(jì)南：山東師范大學(xué)，2009.

[3]ApseMP，AharonGS，SneddenWA，etal.Salttoleranceconferredbyover-expressionofavacuolarNa+/H+antiporterinArabidopsis[J].Science，1999，285：1256-1258.

[4]ZhuJK.Plantsalttolerance[J].TrendsPlantSci.，2001，6（2）：66-71.

[5]FujiiH，ZhuJK.AnautophosphorylationsiteoftheproteinkinaseSOS2isimportantforsalttoleranceinArabidopsis[J].MolecularPlant，2009，2：183-190.

[6]HuDG，LiM，LuoH，etal.MolecularcloningandfunctionalcharacterizationofMdSOS2revealsitsinvolvementinsalttoleranceinapplecallusandArabidopsis[J].PlantCell，2012，31：713-722.

[7]KushwahaHR，KumarG，VermaPK，etal.AnalysisofasalinityinducedBjSOS3proteinfromBrassicaindicateittobestructurallyandfunctionallyrelatedtoitsorthologfromArabidopsis[J].PlantPhysiologyandBiochemistry.2011，49（9）：996-1004.

[8]ZhuJK，LiuJ，XiongL.GeneticanalysisofsalttoleranceinArabidopsisthaliana：evidenceofacriticalroleforpotassiumnutrition[J].PlantCell，1998，10：1181-1192.

[9]LiuJ，IshitaniM，HalfterU.TheArabidopsisthalianaSOS2geneencodesaproteinkinasethatisrequiredforsalttolerance[J].Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97（7）：3730-3734.

[10]戴漢川，張曉偉，龍良啟，等.鴨leptin基因在大腸桿菌中的融合表達(dá)及生物學(xué)活性分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，40（11）：2615-2620.

[11]羅文新，張軍，楊海杰，等.一種帶增強(qiáng)子的原核高效表達(dá)載體的構(gòu)建及初步應(yīng)用[J].生物工程學(xué)報，2000，16（5）：578-581.

[12]PatnaikPR.Investigationkrinductioneffectonthesteadystateperformanceofacontinuousforrecombinantβ-galactosidase[J].ProcessBiochemistry，2001，36（11）：1069-1074.

[13]張傳義，孟玉平，孫海峰，等.蘋果AFL1基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在大腸桿菌中的表達(dá)[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（7）：14-16.

[14]李靜，李曉榮，王冬梅，等.擬南芥AtCOR15a抗寒基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及蛋白表達(dá)[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，47（10）：2031-2036.

SOS2是一類公認(rèn)的抗逆相關(guān)基因，在不同物種中關(guān)于其生理及功能的研究較多，但原核表達(dá)的研究則相對較少。本研究以前期試驗中獲得的AhSOS2基因全長cDNA為模板，通過特異性引物，獲得了AhSOS2基因的蛋白編碼區(qū)。在此基礎(chǔ)上，利用pET系列載體，構(gòu)建了AhSOS2基因的原核表達(dá)載體pET-28a-AhSOS2，經(jīng)酶切鑒定及測序正確后，將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)中。經(jīng)誘導(dǎo)及條件優(yōu)化，最終實現(xiàn)了AhSOS2基因在大腸桿菌中的成功表達(dá)。且隨誘導(dǎo)時間的延長，蛋白表達(dá)量提高，1mmol/LIPTG誘導(dǎo)8h，蛋白表達(dá)豐度達(dá)到較高水平，之后隨誘導(dǎo)時間的延長蛋白表達(dá)量略有提高。本試驗結(jié)果為進(jìn)一步研究AhSOS2基因及編碼蛋白的理化性質(zhì)、表達(dá)調(diào)控機(jī)制、空間結(jié)構(gòu)及制備特異性抗體等奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]湯松，禹山林，廖伯壽，等.我國花生產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀、存在問題及發(fā)展對策[J].花生學(xué)報，2010，39（3）：35-38.

[2]邵鳳霞.花生NAC轉(zhuǎn)錄因子的克隆和功能分析[D].濟(jì)南：山東師范大學(xué)，2009.

[3]ApseMP，AharonGS，SneddenWA，etal.Salttoleranceconferredbyover-expressionofavacuolarNa+/H+antiporterinArabidopsis[J].Science，1999，285：1256-1258.

[4]ZhuJK.Plantsalttolerance[J].TrendsPlantSci.，2001，6（2）：66-71.

[5]FujiiH，ZhuJK.AnautophosphorylationsiteoftheproteinkinaseSOS2isimportantforsalttoleranceinArabidopsis[J].MolecularPlant，2009，2：183-190.

[6]HuDG，LiM，LuoH，etal.MolecularcloningandfunctionalcharacterizationofMdSOS2revealsitsinvolvementinsalttoleranceinapplecallusandArabidopsis[J].PlantCell，2012，31：713-722.

[7]KushwahaHR，KumarG，VermaPK，etal.AnalysisofasalinityinducedBjSOS3proteinfromBrassicaindicateittobestructurallyandfunctionallyrelatedtoitsorthologfromArabidopsis[J].PlantPhysiologyandBiochemistry.2011，49（9）：996-1004.

[8]ZhuJK，LiuJ，XiongL.GeneticanalysisofsalttoleranceinArabidopsisthaliana：evidenceofacriticalroleforpotassiumnutrition[J].PlantCell，1998，10：1181-1192.

[9]LiuJ，IshitaniM，HalfterU.TheArabidopsisthalianaSOS2geneencodesaproteinkinasethatisrequiredforsalttolerance[J].Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97（7）：3730-3734.

[10]戴漢川，張曉偉，龍良啟，等.鴨leptin基因在大腸桿菌中的融合表達(dá)及生物學(xué)活性分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，40（11）：2615-2620.

[11]羅文新，張軍，楊海杰，等.一種帶增強(qiáng)子的原核高效表達(dá)載體的構(gòu)建及初步應(yīng)用[J].生物工程學(xué)報，2000，16（5）：578-581.

[12]PatnaikPR.Investigationkrinductioneffectonthesteadystateperformanceofacontinuousforrecombinantβ-galactosidase[J].ProcessBiochemistry，2001，36（11）：1069-1074.

[13]張傳義，孟玉平，孫海峰，等.蘋果AFL1基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在大腸桿菌中的表達(dá)[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（7）：14-16.

[14]李靜，李曉榮，王冬梅，等.擬南芥AtCOR15a抗寒基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及蛋白表達(dá)[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，47（10）：2031-2036.