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自身啟動子調(diào)控miR-7真核表達載體的構(gòu)建及其意義

郭萌萌，廖珍媛，趙娟娟，陶弋婧，胡燕，陳超，秦娜琳，鄭靜，徐林

(遵義醫(yī)學院 免疫學教研室暨貴州省免疫學研究生教育創(chuàng)新基地，貴州 遵義563099)

[摘要]目的 構(gòu)建帶有miR-7自身啟動子的miR-7重組真核表達載體，研究其對人肺癌細胞增殖、遷移和凋亡的影響。方法 預(yù)測miR-7啟動子序列，設(shè)計含有該序列和miR-7前體序列目的片段的引物，PCR擴增后亞克隆入pGL3.0-Basic載體以構(gòu)建miR-7自身啟動子調(diào)控的真核表達載體pGL3.0-Basic-miR-7-promoter(命名為p-miR-7-pro)；將所構(gòu)建載體轉(zhuǎn)染人肺癌95D細胞， Real-time PCR探針法檢測95D細胞中miR-7的表達水平；MTT和克隆形成實驗分別檢測95D細胞的增殖和克隆形成能力；劃痕法觀察95D細胞體外遷移能力的變化；FACS檢測95D細胞的凋亡情況。結(jié)果 酶切和測序結(jié)果證明成功構(gòu)建p-miR-7-pro真核表達載體，轉(zhuǎn)染95D細胞后可有效表達miR-7；與對照組相比，p-miR-7-pro轉(zhuǎn)染組95D細胞的體外增殖能力受到明顯的抑制(0.60±0.03 vs 0.19±0.05，P<0.05)；同時其遷移能力也顯著降低(473±7 vs 99±2，P<0.05)；而細胞凋亡則顯著增加(9.233±0.586 % vs 12.967±0.643%，P<0.05)。結(jié)論 成功構(gòu)建由自身啟動子調(diào)控的miR-7真核表達載體，為后續(xù)研究miR-7在肺癌基因治療中的作用提供重要實驗基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]miR-7；真核表達；肺癌；95D細胞；增殖；遷移；凋亡

啟動子(Promoter)是一段位于結(jié)構(gòu)基因5′端上游區(qū)的DNA序列，是RNA聚合酶特異性識別和結(jié)合的部位，控制基因表達的起始時間、轉(zhuǎn)錄方向、模板鏈以及轉(zhuǎn)錄效率。啟動子的強弱、位點突變以及CpG島的甲基化，都可能導致基因表達的調(diào)控障礙[1-2]。微小RNA(microRNAs，miRNAs)是長約為22個核苷酸的高度保守的單鏈非編碼RNA，它從DNA轉(zhuǎn)錄，但不能翻譯成蛋白，在轉(zhuǎn)錄后水平通過對多重靶基因的負調(diào)節(jié)參與調(diào)控細胞的發(fā)育、分化、增殖和凋亡等多種生物學進程[3-4]。miRNAs啟動子的活性對于miRNAs的表達具有重要作用[5-6]。而近年來的研究顯示，腫瘤的發(fā)生中多種miRNA表達異常與其啟動子的活性密切相關(guān)[7-9]。如Baer C等研究報道，啟動子DNA甲基化與miRNA(miR-21、miR-34a、miR-155等)成熟體的表達成反比，并且miR-21的啟動子甲基化水平與慢性淋巴細胞白血病的發(fā)展密切相關(guān)[5,8]。類似的Lei等研究發(fā)現(xiàn)，啟動子CpG島的高甲基化使miR-129-2-3p表達下調(diào)，從而影響胃癌的發(fā)生發(fā)展[9]。因此，對miRNAs基因啟動子(核心序列)的結(jié)構(gòu)和功能的分析研究，有利于進一步探討腫瘤的發(fā)生機制，同時對于開發(fā)腫瘤臨床基因治療的新靶標也將有非常積極的影響。

微小RNA-7(MicroRNA-7，miR-7)是近年來報道的miRNAs家族成員之一，研究發(fā)現(xiàn)[10-12]它在包括肺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中異常表達，并能夠有效抑制肺癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移侵襲。然而miR-7啟動子活性及調(diào)控機制等仍遠未闡明，在肺癌中異常表達的調(diào)控因素也未明確。因此，本研究擬構(gòu)建了帶有miRNA-7基因自身啟動子的真核表達載體，鑒定其表達活性，并初步探討該載體對人肺癌95D細胞生長、遷移以及凋亡方面的影響，可為后續(xù)研究miRNA-7表達變化調(diào)控因素，明確其在肺癌發(fā)生中的表達調(diào)控機制及在臨床腫瘤基因治療中的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株DH5α大腸桿菌菌株(本實驗室保存)；人源性肺巨細胞癌95D細胞株(中科院生物化學與細胞生物學研究所)。

1.1.2主要試劑與儀器pGL3-Basic、LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑(invitrogen)；限制性內(nèi)切酶NheⅠ、BglⅡ(Takara)；T4連接酶、RevertAidTMFirstStrand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)；PCR試劑、Premix Ex Taq Version2.0、RNAisoTMPlus(Takara)；引入酶切位點包含miR-7啟動子序列引物合成及測序(北京華大基因)；質(zhì)粒抽提試劑盒(天根生化科技有限公司)；miR-7的Real-time PCR探針試劑盒(MBI)；胎牛血清、細胞培養(yǎng)液RPMI 1640(Hyclone)。

IX-51倒置顯微鏡、IX-71倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS)；低溫臺式高速離心機、CO2培養(yǎng)箱(Thermo)；PCR儀、Gel DocTM XR+凝膠成像系統(tǒng)、穩(wěn)壓DNA電泳儀、熒光定量PCR儀(Bio-Rad)；SW-CJ-2FD型超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備廠)。

1.2方法

1.2.1miR-7啟動子的預(yù)測及引物設(shè)計從Pubmed上調(diào)取含miR-7成熟體3’端70 bp基因組序列(基因序列號：AJ550392)，通過GeneBank獲得miR-7成熟體前段5’端-1 068位點到其3’端側(cè)翼+124位點的序列，通過Primer5設(shè)計包含預(yù)測的啟動子區(qū)域的1 302 bp大小的引物；根據(jù)pGL3.0-Basic的MCS區(qū)的酶切位點，篩選并在引物(上游和下游)引入酶切位點(NheⅠ和BglⅡ)；引物序列：上游(引入NheⅠ位點)5’ CTAGCTAGCTAGAGCACCAATAGGGAAGGG-3’；下游引物(引入BglⅡ位點)5’ GAAGATCTTCGAGTCTGCCGATGGGTGT-3’。預(yù)期產(chǎn)物大小，1 302 bp。

1.2.2 pGL3.0-Basic-miR-7-promoter表達載體的構(gòu)建及鑒定抽提人肺癌95D細胞基因組DNA并作為模板，用設(shè)計的引物PCR反應(yīng)擴增包含miR-7啟動子、miR-7和3’段側(cè)翼序列在內(nèi)的目的片段，擴增條件：95 ℃1 min,95 ℃30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 90 s,36個循環(huán)，72 ℃8 min。產(chǎn)物凝膠電泳后回收目的片段(1 302 bp)，送北京華大基因公司測序，用BLAST程序進行結(jié)果比對，結(jié)果顯示啟動子核心序列完整且不存在突變。擴增產(chǎn)物經(jīng)NheⅠ和BglⅡ雙酶切后回收并連入表達載體pGL3.0-Basic(T4DNA連接酶，22 ℃，1 h)。繼而轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細菌E.coli DH5α，挑取其中的陽性克隆(Amp(+))培養(yǎng)后，菌液PCR和凝膠電泳鑒定；并進行質(zhì)粒小量抽提，雙酶切(NheI和BglII)來篩選陽性重組質(zhì)粒，送北京華大基因測序，結(jié)果顯示pGL3.0-Basic-miR-7-promoter表達載體構(gòu)建成功，命名為p-miR-7-pro(對應(yīng)的pGL3.0-Basic命名為p-Cont)。

圖1　pGL3.0-Basic-miR-7-promoter真核表達載體的示意圖

1.2.3細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染培養(yǎng)95D細胞，條件：RPMI1640細胞完全培養(yǎng)液(10%胎牛血清、100 mg/mL鏈霉素、1 000μ/mL青霉素以及2 mmol/L谷氨酰胺)，37 ℃、5%CO2。當單層細胞生長達到80%融合后，用胰蛋白酶(0.02%)消化收集細胞，PBS輕柔沖洗，將1×105/mL的細胞接種至6孔板(每孔2 mL)，培養(yǎng)12 h ，按照LipofectamineTM2 000轉(zhuǎn)染試劑說明書瞬時轉(zhuǎn)染95D細胞。實驗分為2組：pGL3.0-Basic-miR-7-promoter(p-miR-7-pro)和pGL3.0-Basic空載(p-Cont)轉(zhuǎn)染組。所有細胞實驗n=3，每個實驗重復(fù)3次。

1.2.4p-miR-7-pro轉(zhuǎn)染95D細胞表達水平的檢測將1×105/mL的細胞接種于24孔板(每孔500μL)，10 μg質(zhì)粒p-miR-7-pro和對照質(zhì)粒p-Cont體外分別瞬時轉(zhuǎn)染95D細胞，5% CO2，37 ℃條件下培養(yǎng)48 h后，抽提各組細胞總RNA，利用Realtime PCR探針法檢測miR-7的表達水平。

1.2.5p-miR-7-pro轉(zhuǎn)染對95D細胞增殖的影響轉(zhuǎn)染48 h后，分別收集2個轉(zhuǎn)染組的細胞懸液，以1.5×104/mL個細胞接種于96孔板(每孔200 μL)，培養(yǎng)72 h(37 ℃、5%CO2)，每孔加入50 μL MTT液(2 μg/mL)，孵育4 h，吸出培養(yǎng)基，每孔加入DMSO液150 μL，微孔板振蕩器振蕩培養(yǎng)板10 min，溶解結(jié)晶物，酶標儀檢測各孔的吸光度(OD)值(波長570 nm)。

1.2.6p-miR-7-pro轉(zhuǎn)染對95D細胞體外克隆形成的影響轉(zhuǎn)染48 h后，分別收集2個轉(zhuǎn)染組的細胞，將細胞懸液按每孔100、1 000個細胞接種于6孔板中并確保細胞均勻分散；培養(yǎng)10～15 d，期間根據(jù)情況更換新鮮培養(yǎng)基，當有肉眼可見的克隆后即可終止培養(yǎng)，吸掉培養(yǎng)基并用PBS輕柔洗滌2～3次，自然干燥后固定30 min(4%多聚甲醛)，吸出甲醛待其干燥后，使用結(jié)晶紫染液(1%)染色30 min，PBS輕柔多次清洗直至洗去染液，自然干燥后拍照記錄。

1.2.7p-miR-7-pro轉(zhuǎn)染對95D細胞遷移的影響收集95D細胞，以7×104/mL接種于24孔板，待細胞充分貼壁后，分別將p-miR-7-pro和p-Cont載體瞬時轉(zhuǎn)染入細胞，6h后用1 mL槍頭于每孔中線處劃出2 mm的刮痕，PBS洗滌2～3次直至刮痕內(nèi)無細胞后加入新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，顯微鏡下觀察計算刮痕內(nèi)的細胞數(shù)，并拍照。

1.2.8p-miR-7-pro轉(zhuǎn)染對95D細胞凋亡的影響收集轉(zhuǎn)染后48h的p-miR-7-pro和p-Cont轉(zhuǎn)染組細胞，制成細胞懸液，PBS洗1次，過濾，離心，棄上清，每管加入Annexin V-APC熒光標記抗體2 μL，4 ℃避光孵育10～15 min，PBS洗滌2遍，每管分別加入PI 熒光標記抗體2 μL，冰上避光孵育10 min ，F(xiàn)ACS檢測。

2結(jié)果

2.1miR-7 啟動子的預(yù)測如圖2所示，通過GeneBank獲得miR-7前段5’端-1068位點到其3’端側(cè)翼+124位點的序列，利用Primer5設(shè)計對應(yīng)引物；引物序列：上游，5’ CTAGCTAGCTAGAGCACCAATAGGGAAGGG-3’;下游引物：5’ GAAGATCTTCGAGTCTGCCGATGGGTGT-3’。預(yù)期產(chǎn)物大小1 302 bp。

圖2　miR-7啟動子區(qū)域示意圖

2.2PCR擴增miR-7啟動子區(qū)序列以肺癌95D細胞DNA為模板，PCR擴增含miR-7成熟體3’端70 bp堿基的啟動子序列，如圖3所示，電泳后可見1 302 bp大小的目的條帶。

M:Marker?！　　D3　miR-7啟動子PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

2.3p-miR-7-pro載體陽性克隆PCR鑒定純化的目的片段經(jīng)雙酶切后(NheⅠ和BglII)連入pGL3.0-Basic載體，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細菌E.coli DH5α，Amp(+)培養(yǎng)12 h后隨機挑取6個克隆，繼續(xù)培養(yǎng)16 h，最后菌液PCR擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳，6個克隆培養(yǎng)擴增后均可見1302 bp大小的目的條帶(見圖4)，提示其均為陽性克隆。

1～6:6個不同的克降培養(yǎng)后菌液PCR擴增結(jié)果；M：Marker。圖4　菌液PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

2.4p-miR-7-pro載體的酶切和測序鑒定重組載體p GL3.0-Basic-miR-7-pro經(jīng)雙酶切后(NheI,Bgl Ⅱ)，電泳結(jié)果可見約4.8 kb及1302 bp大小的2條片段 (見圖5A)；測序結(jié)果顯示(見圖5B)，插入片段正確 ，結(jié)果表明pGL3.0-miR-7-promoter表達載體構(gòu)建成功，命名為p-miR-7-pro(對應(yīng)的pGL3.0-Basic命名為p-Cont)。

A:重組質(zhì)粒雙酶切結(jié)果 (M:Marker);B:重組質(zhì)粒測序結(jié)果圖5　重組質(zhì)粒雙酶切與測序鑒定

2.595D細胞轉(zhuǎn)染p -miR-7 -pro載體后miR-7表達水平檢測轉(zhuǎn)染48h后，利用Real-time PCR探針法檢測miR-7成熟體的表達水平。如圖6所示，p-miR-7-pro轉(zhuǎn)染組miR-7成熟體的表達水平較p-Cont組顯著升高，提示該啟動子可以有效啟動miR-7的表達。

2.6p-miR-7-pro轉(zhuǎn)染抑制95D細胞的增殖MTT實驗結(jié)果(見圖7)顯示，與對照組相比，p -miR-7-pro轉(zhuǎn)染組細胞的增殖能力明顯降低。

*P<0.05,vs-p-Cont。　　圖6　Real-time PCR檢測p-miR-7-pro轉(zhuǎn)染95D細胞后miR-7的表達

*P<0.05, vs p-Cont。　圖7　p-miR-7-pro轉(zhuǎn)染抑制95D細胞體外增殖

2.7p-miR-7-pro轉(zhuǎn)染對95D細胞體外克隆形成的影響克隆形成實驗結(jié)果(見圖8)顯示，每孔100和1000個細胞的接種條件下，p-miR-7-pro轉(zhuǎn)染組95D細胞克隆形成數(shù)均較p-Cont組明顯減少(14±4vs31±5個; 77±7vs122±6個，P<0.05)。結(jié)果表明，miR-7既可以抑制肺癌95D細胞的增殖，也可以影響其克隆形成的能力。

2.8p-miR-7-pro轉(zhuǎn)染抑制95D細胞的遷移劃痕法結(jié)果(見圖9)顯示，與p-Cont轉(zhuǎn)染組細胞相比，p-miR-7-pro組95D細胞的體外遷移能力受到了明顯的抑制，48h后p-miR-7-pro-95D轉(zhuǎn)染組細胞的遷移數(shù)明顯少于p-Cont組 ：(99±2vs473±7，P<0.05)，72h 后為 (399±6vs1339±20，P<0.05)。結(jié)果提示，miR-7過表達可以抑制95D細胞的體外遷移能力。

2.9p-miR-7-pro轉(zhuǎn)染誘導95D細胞的凋亡采用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡的變化。結(jié)果(見圖10)顯示，與對照組相比，p-miR-7-pro轉(zhuǎn)染組細胞的凋亡比例明顯增加 (9.233±0.586%vs12.967±0.643%，P<0.05)。結(jié)果表明，過表達miR-7可誘導肺癌細胞95D細胞凋亡增加。

A:1000個細胞/孔；B:100個細胞/孔；*P<0.05，vs p-Cont。圖8　 p-miR-7-pro轉(zhuǎn)染抑制95D細胞的克隆形成能力

A:0 h (100×);B:48 h (100×);C:72 h(100×)；*P<0.05，vs p-Cont。圖9　p-miR-7-pro轉(zhuǎn)染抑制95D細胞體外遷移

*P<0.05,vs p-Cot。圖10　p-miR-7-pro轉(zhuǎn)染后誘導95D細胞的凋亡

3討論

MiRNA-7是新近報道的miRNA家族成員之一，定位于第15號染色體。研究發(fā)現(xiàn)，miR-7在正常肺組織中高表達，但在臨床肺癌組織中呈現(xiàn)低表達；當過表達miR-7時，肺癌細胞的生長、轉(zhuǎn)移以及侵襲能力都受到明顯的抑制[13-14]。這與我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)miR-7模擬物(mimics)和真核表達載體可過表達miR-7，并通過下調(diào)IGFIR、EGFR和p-Akt的表達水平，從而顯著抑制肺癌細胞的體外增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲是一致的[15-18]。這些研究均提示miRNA-7是肺癌發(fā)生發(fā)展中的重要調(diào)控分子。因此進一步明確miR-7在肺癌發(fā)生中的表達調(diào)控機制，對于miR-7基因功能的研究，以及在臨床腫瘤治療中利用miR-7進行基因診斷、預(yù)防和治療都具有十分重要的作用。

由于miRNAs分子在基因組上定位的復(fù)雜性，導致對其啟動子鑒定和活性研究工作開展較為困難。本研究利用生物信息學分析發(fā)現(xiàn)[19]，在miR-7成熟體前段至其5’端-1068位點間存在多個轉(zhuǎn)錄因子(如，Gfi-1，c-Myc等)的潛在結(jié)合位點，提示該段序列具有啟動子活性。為了驗證該段序列是否為miR-7啟動子序列，本實驗利用分子克隆技術(shù)，設(shè)計含miR-7啟動子、miR-7和3’段側(cè)翼序列在內(nèi)的目的片段的引物，以人肺巨細胞癌細胞系95D基因組DNA為模板，擴展出1302bp大小的目的片段；經(jīng)NheI和BglⅡ雙酶切、純化后亞克隆入無啟動子、增強子的pGL3.0-Basic載體，從而構(gòu)建miRNA-7自身啟動子的miR-7真核表達載體；酶切和測序結(jié)果表明，成功構(gòu)建載體pGL3.0-Basic-miR-7-promoter(命名為p-miR-7-pro)。更重要的是，將該載體瞬時轉(zhuǎn)染人肺癌95 D細胞后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染組miR-7成熟體的表達水平顯著增加，這提示miR-7成熟體前段至其5’端-1068位點間存在miR-7自身啟動子，其可有效啟動miR-7成熟體的表達。進一步觀察發(fā)現(xiàn)p-miR-7-pro過表達的miR-7可顯著抑制人肺癌95D細胞的體外增殖和遷移能力，這與我們前期結(jié)果一致[16-18]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)95D細胞的凋亡也明顯增加。類似地，Xiong[20]等報道過表達miR-7可以在體外誘導人肺癌 A549細胞的凋亡。新近，Li等還發(fā)現(xiàn)人抗原R (human antigen R, HuR)可以在mRNA水平調(diào)控miR-7成熟體的表達[21]，這些研究提示了miR-7在肺癌中表達調(diào)控機制的復(fù)雜性。因此，深入探討miR-7啟動子活性變化機制對于最終闡明以miR-7為代表的miRNA分子在人肺癌發(fā)生中的作用具有重要意義。

總之，本研究成功構(gòu)建帶有miRNA-7自身啟動子的真核表達載體，并觀察其對肺癌95D細胞的影響，這對于進一步研究肺癌發(fā)生中miR-7表達的調(diào)控機制，以及針對肺癌臨床基因治療中基于miR-7治療新方案的開發(fā)具有重要意義。

[參考文獻]

[1] Laird P W.The power and the promise of DNA methylation markers[J].Nat Rev Cancer,2003,3(4):253-266.

[2] Bird A.The essentials of DNA methylation[J].Cell,1992,70(1):5-8.

[3] Lee R C,Feinbaum R L,Ambros V.The C.elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14[J].Cell,1993,75(5):843-854.

[4] Bartel D P.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,and function[J].Cell,2004,116(2):281-297.

[5] Baer C,Claus R,Frenzel L P,et al.Extensive promoter DNA hypermethylation and hypomethylation is associated with aberrant microRNA expression in chronic lymphocytic leukemia[J].Cancer Res,2012,72(15):3775-3785.

[6] Salmanidis M,Pillman K,Goodall G,et al.Direct transcriptional regulation by nuclear microRNAs[J].Int J Biochem Cell Biol,2014,54C:304-311.

[7] Weber B,Stresemann C,Brueckner B,et al.Methylation of human microRNA genes in normal and neoplastic cells[J].Cell Cycle,2007,6(9):1001-1005.

[8] Baer C,Claus R,Plass C.Genome-wide epigenetic regulation of miRNAs in cancer[J].Cancer Res,2013,73(2):473-477.

[9] Lei H,Zou D,Li Z,et al.MicroRNA-219-2-3p functions as a tumor suppressor in Gastric cancer and is regulated by DNA methylation[J].PLoS One,2013,8(4):e60369.

[10] Xu K,Chen Z,Qin C,et al.miR-7 inhibits colorectal cancer cell proliferation and induces apoptosis by targeting XRCC2[J].Onco Targets Ther,2014,7:325-332.

[11] LiY,Li Y,Liu Y,et al.PAX6, a Novel Target of microRNA-7,Promotes Cellular Proliferation and Invasion in Human Colorectal Cancer Cells[J].Dig Dis Sci,2014,59(3):598-606.

[12] Kefas B,Godlewski J,Comeau L,et al.microRNA-7 inhibits the epidermal growth factor receptor and the Akt pathway and is down-regulated in glioblastoma[J].Cancer Res,2008,68(10):3566-3572.

[13] 鄭靜,李穎,秦安東,等.miRNA-7 在小鼠不同組織器官中表達的檢測及其意義[J].遵義醫(yī)學院學報,2012,35(2):91-97.

[14] 朱順飛,廖珍媛,胡燕,等.微小RNA-7過表達對人肺癌細胞體內(nèi)外轉(zhuǎn)移的影響[J].遵義醫(yī)學院學報,2013,36(5):401-405.

[15] Xu L,Wen Z,Zhou Y,et al.MicroRNA-7-regulated TLR9 signaling-enhanced growth and metastatic potential of human lung cancer cells by altering the phosphoinositide-3-kinase, regulatory subunit 3/Akt pathway[J].Mol Biol Cell,2013,24(1):42-55.

[16] 徐林,任濤,秦安東,等.microRNA-7 對人肺癌 95D 細胞體外侵襲的作用[J].遵義醫(yī)學院學報,2011,34(1):12-16.

[17] 宋永祥,李穎,秦安東,等.miRNA-7真核表達載體的構(gòu)建與鑒定[J].西安交通大學學報,2013,34(9):454-459.

[18] 陳超,趙娟娟,胡艷,等. TTF-1啟動子調(diào)控microRNA-7真和表達載體的構(gòu)建[J].遵義醫(yī)學院學報,2014,37(3):263-270.

[19] Chou Y T,Lin H H,Lien Y C,et al.EGFR promotes lung tumorigenesis by activating miR-7 through a Ras/ERK/Myc pathway that targets the Ets2 transcriptional repressor ERF[J]. Cancer Res,2010,70(21):8822-8831.

[20] Xiong S,Zheng Y,Jiang P,et al.MicroRNA-7 Inhibits the growth of human non-small cell lung cancer A549 Cells through Targeting BCL-2[J].Int J Biol Sci,2011,7(6):805-814.

[21] Li YJ,Wang C H,Zhou Y,et al.TLR9 signaling repressed tumor suppressor miR-7 expression through up-regulation of HuR in human lung cancer cells[J].Cancer Cell Int,2013,13(1):90.

[收稿2015-03-11;修回2015-04-26]

(編輯：譚秀榮)

·學術(shù)動態(tài)·

Construction of an eukaryotic expression vector encoding miRNA-7 with self promoter and its significance

GuoMengmeng，LiaoZhenyuan，ZhaoJuanjuan，TaoYijing，HuYan，ChenChao，QinNalin，ZhengJing，XuLin

(Department of Immunology，Immunology Graduate Education and Innovation Base of Guizhou Province，Zunyi Medical University，Zunyi Guizhou 563099，China)

[Abstract]Objective To construct an eukaryotic expression vector encoding miRNA-7 (miR-7) with its own promoter and explore its effects on the growth, migration and apoptosis of lung cancer cells.Methods The PCR primer was designed to amplify the promoter sequence and precursor sequence fragment of miR-7. The PCR products were subcloned into pGL3.0-Basic vector to construct the eukaryotic expression vector pGL3.0-Basic-miR-7-promoter (Named as p-miR-7-pro). Then, the recombinant plasmid p-miR-7-pro was transiently transfected into human lung cancer cell line 95D cells in vitro. The expression level of miR-7 in 95D cells was detected by real-time PCR. The proliferation and colony formation ability of cells were detected by MTT assay and colony formation assay, respectively. The migration of cells in vitro was determined by scratch assay. The apoptosis of cells was investigated by flow cytometry analysis.Results Enzyme digestion and DNA sequencing validated the successful construction of p-miR-7-pro eukaryotic expression vector. The expression level of miR-7 in p-miR-7-pro transfected group was higher than that in control group. Moreover, compared with control group (p-Cont), the proliferation and migration ability of cells in p-miR-7-pro-transfected group significantly decreased, respectively(0.60±0.03 vs 0.19±0.05，P<0.05)(473±7 vs 99±2，P<0.05). Conversely, the apoptosis of 95D cells significantly increased (9.233±0.586 % vs 12.967±0.643%, P<0.05).Conclusion The eukaryotic expression vector encoding miRNA-7 with self promoter is successfully constructed, which provides an important foundation for the study on the effects of miR-7 in gene therapy against lung cancer.

[Key words]miR-7; eukaryotic expression; lung cancer; 95D cell; proliferation; migration；apoptosis

[文獻標志碼][中圖法分類號] R734.2 A

[文章編號]1000-2715(2015)03-0219-07

[基金項目]國家自然科學基金資助項目(NO:31370918)；教育部新世紀優(yōu)秀人才計劃資助項目(NO:NCET-12-0661);貴州省國際合作項目(NO:10C315)。[通信作者]徐林，男，博士，教授，碩士生導師，研究方向：腫瘤免疫，E-mail:xulinzhouya@163.com。