王海燕+葉兆偉+陳瓊

摘要：探索纖維素酶法提取制備復(fù)方半邊蓮注射液的最佳工藝條件，采用單因素試驗和正交試驗設(shè)計，運用纖維素酶法提取制備復(fù)方半邊蓮注射液，并以HPLC法檢測指標(biāo)成分野黃芩苷含量為指標(biāo)。結(jié)果表明，各因素的影響次序為酶解溫度、pH、酶用量、酶解時間，最佳工藝條件為酶解溫度45 ℃，酶用量為7.2 mg/g，最適pH為5.0，酶解時間為60 min。在此條件下，復(fù)方半邊蓮注射液中野黃芩苷含量為2.42 mg/mL，明顯大于注冊標(biāo)準中煎煮法野黃芩苷含量1.34 mg/mL。相對原注冊標(biāo)準煎煮法，纖維素酶法提取制備復(fù)方半邊蓮注射液工藝簡單可行，具有提取效率高、生產(chǎn)周期短等優(yōu)點。

關(guān)鍵詞：纖維素酶;復(fù)方半邊蓮注射液;野黃芩苷;正交試驗

中圖分類號：R284.2 ? ? ? ?文獻標(biāo)識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）20-4946-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.20.046

Technologies of Extracting Compound Lobelia Injection with Cellulase

WANG Hai-yan，YE Zhao-wei，CHEN Qiong

（Xinyang College of Agriculture and Forestry/Xinyang Traditional Chinese Medicine Resources Development Engineering Research Center， Xinyang 464000， Henan， China）

Abstract： The conditions of extracting compound lobelia injection with cellulase were optimized. The scutellarin of compound lobelia injection was extracted by cellulase and determined by HPLC in orthogonal experiment. The optimal conditions were the enzymolysis temperature of 45 ℃， the pH of 5.0， the enzymolysis time of 60 minutes. Under these conditions， the content of scutellarin in compound lobelia injection was 2.42 mg/mL， significantly more than 1.34 mg/mL through decocting technology contained in registration standards. Cellulase extraction of compound lobelia injection is simple and feasible， with advantages of high efficiency and short production duration.

Key words： cellulase; compound lobelia injection; scutellarin; orthogonal experiment

復(fù)方半邊蓮注射液為河南同源制藥有限公司獨家生產(chǎn)的中藥注射液，處方主要組成為半邊蓮、半枝蓮、白花蛇舌草，具有清熱解毒消腫止痛功效。用于多發(fā)性癤腫、扁桃腺炎、乳腺炎等[1]。因其能明顯抑制癌細胞的細胞核分裂，抑制DNA的合成，從而達到抑制癌細胞的增殖、復(fù)制，故也可配合化療用于腫瘤的治療[1]。近年來還有文獻報道復(fù)方半邊蓮注射液可治療小兒支氣管肺炎[2]、配合西藥治療毛細支氣管炎[3]、小兒急性支氣管炎[4]、小兒支原體肺炎[5]、小兒或成人急性呼吸道感染[6]、嬰幼兒秋冬季腹瀉[7]、外感高熱[8]等。

纖維素酶是一組能夠降解纖維素生成葡萄糖的酶的總稱。纖維素是半邊蓮、半枝蓮、白花蛇舌草等藥材細胞壁的主要成分，亦是胞內(nèi)苷等大分子化合物溶出的主要屏障，利用纖維素酶水解細胞壁，有利于胞內(nèi)成分的溶出[9，10]。復(fù)方半邊蓮注射液原注冊標(biāo)準的提取方法為煎煮法[1]，本試驗在單因素試驗基礎(chǔ)上應(yīng)用正交設(shè)計優(yōu)化纖維素酶提取制備復(fù)方半邊蓮注射液的工藝條件，探索各因素對指標(biāo)性成分野黃芩苷含量的影響，以期達到提高提取效率、縮短提取時間和降低能耗，為生產(chǎn)復(fù)方半邊蓮注射液的工藝改進提供理論依據(jù)，并為酶技術(shù)在中藥制劑方面的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料與試劑

半邊蓮、半枝蓮、白花蛇舌草購于信陽市藥材站（經(jīng)河南同源制藥有限公司檢驗合格），野黃芩苷標(biāo)準品（中國藥品生物制品檢驗所，批號110842-201106），纖維素酶（北京奧博星生物有限公司，批號20110910），去離子水（自制），注射用水（自制），乙醇、氫氧化鈉、鹽酸、醋酸（均為分析純），甲醇（色譜純），一級針用活性炭。

1.2 ?儀器

電磁爐（美的）;液相色譜儀（安捷倫1100）;SHB-3型循環(huán)水多用真空泵（鄭州杜甫儀器廠）;水循環(huán)恒溫水浴箱（上海智城分析儀器制造有限公司）;PB602-S型電子天平（梅特勒）;H1221型精密pH計（ 上海精密科學(xué)儀器有限公司）;101AS-2型電熱恒溫干燥箱（上海實驗儀器有限公司）;200型板框過濾機（禹州市強國化工設(shè)備有限公司）;薄膜過濾器;ARF安瓿熔封機（鄭州玉祥機械設(shè)備有限公司）。

1.3 ?試驗方法

1.3.1 ?藥材處理 ?將半邊蓮、半枝蓮、白花蛇舌草挑揀淘洗后于105 ℃烘干備用。

1.3.2 ?野黃芩苷含量測定[2] ?色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;甲醇-水-醋酸（35∶61∶4）為流動相;檢測波長為335 nm。理論板數(shù)按野黃芩苷峰計算應(yīng)不低于1 500。精密稱取野黃芩苷標(biāo)準品適量，加20%甲醇溶解，制成50 μg/mL的溶液，即得標(biāo)準品溶液。精密移取復(fù)方半邊蓮注射液2 mL，置10 mL容量瓶中，加20%甲醇稀釋至刻度，搖勻，以微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

1.3.3 ?提取方法

1）原注冊標(biāo)準提取方法[1]。準確稱取半邊蓮、半枝蓮、白花蛇舌草各50 g，加去離子水煎煮兩次，第一次藥材10倍量水煎煮2 h，第二次藥材5倍量水煎煮1 h，合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.15（55～60 ℃）的清膏，加乙醇至含醇量為65%，靜置12 h，濾過，濾液調(diào)節(jié)pH 8.0～8.5，靜置1 h，濾過，濾液回收乙醇至無醇味，加注射用水至50 mL，調(diào)節(jié)pH 2.0～3.0，加活性炭5 g，攪拌均勻，煮沸30 min，濾過，濾液調(diào)節(jié)pH 6.0，冷藏24 h，濾過，再調(diào)節(jié)pH 6.0～7.0，加注射用水至100 mL，灌封，100 ℃煮沸滅菌30 min。

2）纖維素酶纖維素酶提取法。準確稱取半邊蓮、半枝蓮、白花蛇舌草各50 g，加10倍藥材量純化水，加纖維素酶、調(diào)節(jié)pH、調(diào)溫度并酶解規(guī)定時間，按L9（34） 正交表設(shè)計試驗，對9組試驗條件下制得的復(fù)方半邊蓮注射液中野黃芩苷的含量進行測定。清膏的純化與注射液的制備同原注冊標(biāo)準。因素與水平見表1。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?纖維素酶提取法的單因素試驗結(jié)果

2.1.1 ?酶解時間對野黃芩苷含量的影響 ?由圖1可知，酶解時間達到60 min時，分解趨于完全，野黃芩苷大部分已溶出，隨著反應(yīng)時間的延長，其含量增加幅度不明顯，因此酶解時間選擇60 min較合適。

2.1.2 ?酶解溫度對野黃芩苷含量的影響 ?由圖2可知，在其他條件相同的情況下，45 ℃酶解的野黃芩苷含量高于其他溫度，說明45 ℃為所用纖維素酶的最適溫度。

2.1.3 ?酶解pH對野黃芩苷含量的影響 ?由圖3可知，在其他條件相同的情況下，酶解pH為5.0時，野黃芩苷含量最高，說明pH 5.0為所用纖維素酶的最適pH。

2.1.4 ?酶用量對野黃芩苷含量的影響 ?由圖4可知，酶用量從6.0～7.0 mg/g，野黃芩苷含量顯著提高，后趨于平緩，說明7.0 mg/g的酶用量已能將樣品最大程度酶解。

2.2 ?正交試驗結(jié)果

正交試驗結(jié)果如表2所示。由極差R的大小可知，纖維素酶提取法中各因素對野黃芩苷提取率影響的主次順序為酶解溫度、酶解pH、酶用量、酶解時間，即酶解溫度為主要影響因素，酶解時間影響最小。在考察范圍內(nèi)，最佳工藝條件可選擇為A2B2C2D3，即酶解時間60 min、酶解溫度45 ℃、酶解pH 5.0、酶用量7.2 mg/g。驗證試驗結(jié)果表明，在該條件下，野黃芩苷平均含量為2.42 mg/mL，較原注冊標(biāo)準提取方法（野黃芩苷含量1.34 mg/mL）提高了80.6%。

3 ?結(jié)論

通過對運用纖維素酶法提取制備復(fù)方半邊蓮注射液工藝的探討，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用正交試驗設(shè)計，確定復(fù)方半邊蓮注射液的最佳提取工藝參數(shù)為A2B2C2D3，即酶解時間60 min、酶解溫度45 ℃、酶解pH 5.0、酶用量7.2 mg/g，在此條件下，復(fù)方半邊蓮注射液中野黃芩苷的平均含量為2.42 mg/mL，與注冊標(biāo)準中的煎煮法相比，野黃芩苷含量高出80.6%，提高了有效成分的提取率，而且提取時間由原來3 h縮短至60 min，大大節(jié)約了能源，減少了人工勞動強度，縮短了生產(chǎn)周期，為復(fù)方半邊蓮注射液提取工藝的改進提供了參考依據(jù)。

參考文獻：

[1] 王守英.復(fù)方半邊蓮注射液定性定量標(biāo)準研究察[J].中外健康文摘（醫(yī)藥月刊），2007，4（11）：210-212.

[2] 周金平，苗桂杰，肖國富.復(fù)方半邊蓮注射液佐治小兒支氣管肺炎30例[J].中國煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2004，7（9）：893-893.

[3] 何建國，周京麗，門 ?猛.復(fù)方半邊蓮注射液配合西藥治療毛細支氣管炎臨床觀察[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2004，13（21）：2836-2837.

[4] 何建國，許志強，侯云峰.復(fù)方半邊蓮注射液治療小兒急性支氣管炎98例[J].實用中醫(yī)內(nèi)科雜志，2004，18（4）：366.

[5] 段曉征.小兒支原體肺炎的臨床觀察[D].長春：長春中醫(yī)學(xué)院，2004.

[6] 呂輝文，許培玲.復(fù)方半邊蓮注射液治療小兒急性呼吸道感染[J].福建醫(yī)藥雜志，2011，33（5）：123-124.

[7] 李鳳君，謝志儒.復(fù)方半邊蓮治療嬰幼兒秋冬季腹瀉臨床觀察[J].中國實用鄉(xiāng)村醫(yī)生雜志，2006，13（5）：43.

[8] 薛宏利.復(fù)方半邊蓮注射液治療外感高熱130例[J].實用中醫(yī)內(nèi)科雜志，2002，16（4）：235-237.

[9] 余洪波，張曉昱.酶法在中藥提取中的研究進展[J].中成藥，2005，27（5）：591-593.

[10] 姜彬慧，左小紅，趙余慶，等.酶技術(shù)與中藥現(xiàn)代化[J].世界科學(xué)技術(shù)（中醫(yī)藥現(xiàn)代化），2004，6（2）：46-49.

1.3 ?試驗方法

1.3.1 ?藥材處理 ?將半邊蓮、半枝蓮、白花蛇舌草挑揀淘洗后于105 ℃烘干備用。

1.3.2 ?野黃芩苷含量測定[2] ?色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;甲醇-水-醋酸（35∶61∶4）為流動相;檢測波長為335 nm。理論板數(shù)按野黃芩苷峰計算應(yīng)不低于1 500。精密稱取野黃芩苷標(biāo)準品適量，加20%甲醇溶解，制成50 μg/mL的溶液，即得標(biāo)準品溶液。精密移取復(fù)方半邊蓮注射液2 mL，置10 mL容量瓶中，加20%甲醇稀釋至刻度，搖勻，以微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

1.3.3 ?提取方法

1）原注冊標(biāo)準提取方法[1]。準確稱取半邊蓮、半枝蓮、白花蛇舌草各50 g，加去離子水煎煮兩次，第一次藥材10倍量水煎煮2 h，第二次藥材5倍量水煎煮1 h，合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.15（55～60 ℃）的清膏，加乙醇至含醇量為65%，靜置12 h，濾過，濾液調(diào)節(jié)pH 8.0～8.5，靜置1 h，濾過，濾液回收乙醇至無醇味，加注射用水至50 mL，調(diào)節(jié)pH 2.0～3.0，加活性炭5 g，攪拌均勻，煮沸30 min，濾過，濾液調(diào)節(jié)pH 6.0，冷藏24 h，濾過，再調(diào)節(jié)pH 6.0～7.0，加注射用水至100 mL，灌封，100 ℃煮沸滅菌30 min。

2）纖維素酶纖維素酶提取法。準確稱取半邊蓮、半枝蓮、白花蛇舌草各50 g，加10倍藥材量純化水，加纖維素酶、調(diào)節(jié)pH、調(diào)溫度并酶解規(guī)定時間，按L9（34） 正交表設(shè)計試驗，對9組試驗條件下制得的復(fù)方半邊蓮注射液中野黃芩苷的含量進行測定。清膏的純化與注射液的制備同原注冊標(biāo)準。因素與水平見表1。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?纖維素酶提取法的單因素試驗結(jié)果

2.1.1 ?酶解時間對野黃芩苷含量的影響 ?由圖1可知，酶解時間達到60 min時，分解趨于完全，野黃芩苷大部分已溶出，隨著反應(yīng)時間的延長，其含量增加幅度不明顯，因此酶解時間選擇60 min較合適。

2.1.2 ?酶解溫度對野黃芩苷含量的影響 ?由圖2可知，在其他條件相同的情況下，45 ℃酶解的野黃芩苷含量高于其他溫度，說明45 ℃為所用纖維素酶的最適溫度。

2.1.3 ?酶解pH對野黃芩苷含量的影響 ?由圖3可知，在其他條件相同的情況下，酶解pH為5.0時，野黃芩苷含量最高，說明pH 5.0為所用纖維素酶的最適pH。

2.1.4 ?酶用量對野黃芩苷含量的影響 ?由圖4可知，酶用量從6.0～7.0 mg/g，野黃芩苷含量顯著提高，后趨于平緩，說明7.0 mg/g的酶用量已能將樣品最大程度酶解。

2.2 ?正交試驗結(jié)果

正交試驗結(jié)果如表2所示。由極差R的大小可知，纖維素酶提取法中各因素對野黃芩苷提取率影響的主次順序為酶解溫度、酶解pH、酶用量、酶解時間，即酶解溫度為主要影響因素，酶解時間影響最小。在考察范圍內(nèi)，最佳工藝條件可選擇為A2B2C2D3，即酶解時間60 min、酶解溫度45 ℃、酶解pH 5.0、酶用量7.2 mg/g。驗證試驗結(jié)果表明，在該條件下，野黃芩苷平均含量為2.42 mg/mL，較原注冊標(biāo)準提取方法（野黃芩苷含量1.34 mg/mL）提高了80.6%。

3 ?結(jié)論

通過對運用纖維素酶法提取制備復(fù)方半邊蓮注射液工藝的探討，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用正交試驗設(shè)計，確定復(fù)方半邊蓮注射液的最佳提取工藝參數(shù)為A2B2C2D3，即酶解時間60 min、酶解溫度45 ℃、酶解pH 5.0、酶用量7.2 mg/g，在此條件下，復(fù)方半邊蓮注射液中野黃芩苷的平均含量為2.42 mg/mL，與注冊標(biāo)準中的煎煮法相比，野黃芩苷含量高出80.6%，提高了有效成分的提取率，而且提取時間由原來3 h縮短至60 min，大大節(jié)約了能源，減少了人工勞動強度，縮短了生產(chǎn)周期，為復(fù)方半邊蓮注射液提取工藝的改進提供了參考依據(jù)。

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[3] 何建國，周京麗，門 ?猛.復(fù)方半邊蓮注射液配合西藥治療毛細支氣管炎臨床觀察[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2004，13（21）：2836-2837.

[4] 何建國，許志強，侯云峰.復(fù)方半邊蓮注射液治療小兒急性支氣管炎98例[J].實用中醫(yī)內(nèi)科雜志，2004，18（4）：366.

[5] 段曉征.小兒支原體肺炎的臨床觀察[D].長春：長春中醫(yī)學(xué)院，2004.

[6] 呂輝文，許培玲.復(fù)方半邊蓮注射液治療小兒急性呼吸道感染[J].福建醫(yī)藥雜志，2011，33（5）：123-124.

[7] 李鳳君，謝志儒.復(fù)方半邊蓮治療嬰幼兒秋冬季腹瀉臨床觀察[J].中國實用鄉(xiāng)村醫(yī)生雜志，2006，13（5）：43.

[8] 薛宏利.復(fù)方半邊蓮注射液治療外感高熱130例[J].實用中醫(yī)內(nèi)科雜志，2002，16（4）：235-237.

[9] 余洪波，張曉昱.酶法在中藥提取中的研究進展[J].中成藥，2005，27（5）：591-593.

[10] 姜彬慧，左小紅，趙余慶，等.酶技術(shù)與中藥現(xiàn)代化[J].世界科學(xué)技術(shù)（中醫(yī)藥現(xiàn)代化），2004，6（2）：46-49.

1.3 ?試驗方法

1.3.1 ?藥材處理 ?將半邊蓮、半枝蓮、白花蛇舌草挑揀淘洗后于105 ℃烘干備用。

1.3.2 ?野黃芩苷含量測定[2] ?色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;甲醇-水-醋酸（35∶61∶4）為流動相;檢測波長為335 nm。理論板數(shù)按野黃芩苷峰計算應(yīng)不低于1 500。精密稱取野黃芩苷標(biāo)準品適量，加20%甲醇溶解，制成50 μg/mL的溶液，即得標(biāo)準品溶液。精密移取復(fù)方半邊蓮注射液2 mL，置10 mL容量瓶中，加20%甲醇稀釋至刻度，搖勻，以微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

1.3.3 ?提取方法

1）原注冊標(biāo)準提取方法[1]。準確稱取半邊蓮、半枝蓮、白花蛇舌草各50 g，加去離子水煎煮兩次，第一次藥材10倍量水煎煮2 h，第二次藥材5倍量水煎煮1 h，合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.15（55～60 ℃）的清膏，加乙醇至含醇量為65%，靜置12 h，濾過，濾液調(diào)節(jié)pH 8.0～8.5，靜置1 h，濾過，濾液回收乙醇至無醇味，加注射用水至50 mL，調(diào)節(jié)pH 2.0～3.0，加活性炭5 g，攪拌均勻，煮沸30 min，濾過，濾液調(diào)節(jié)pH 6.0，冷藏24 h，濾過，再調(diào)節(jié)pH 6.0～7.0，加注射用水至100 mL，灌封，100 ℃煮沸滅菌30 min。

2）纖維素酶纖維素酶提取法。準確稱取半邊蓮、半枝蓮、白花蛇舌草各50 g，加10倍藥材量純化水，加纖維素酶、調(diào)節(jié)pH、調(diào)溫度并酶解規(guī)定時間，按L9（34） 正交表設(shè)計試驗，對9組試驗條件下制得的復(fù)方半邊蓮注射液中野黃芩苷的含量進行測定。清膏的純化與注射液的制備同原注冊標(biāo)準。因素與水平見表1。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?纖維素酶提取法的單因素試驗結(jié)果

2.1.1 ?酶解時間對野黃芩苷含量的影響 ?由圖1可知，酶解時間達到60 min時，分解趨于完全，野黃芩苷大部分已溶出，隨著反應(yīng)時間的延長，其含量增加幅度不明顯，因此酶解時間選擇60 min較合適。

2.1.2 ?酶解溫度對野黃芩苷含量的影響 ?由圖2可知，在其他條件相同的情況下，45 ℃酶解的野黃芩苷含量高于其他溫度，說明45 ℃為所用纖維素酶的最適溫度。

2.1.3 ?酶解pH對野黃芩苷含量的影響 ?由圖3可知，在其他條件相同的情況下，酶解pH為5.0時，野黃芩苷含量最高，說明pH 5.0為所用纖維素酶的最適pH。

2.1.4 ?酶用量對野黃芩苷含量的影響 ?由圖4可知，酶用量從6.0～7.0 mg/g，野黃芩苷含量顯著提高，后趨于平緩，說明7.0 mg/g的酶用量已能將樣品最大程度酶解。

2.2 ?正交試驗結(jié)果

正交試驗結(jié)果如表2所示。由極差R的大小可知，纖維素酶提取法中各因素對野黃芩苷提取率影響的主次順序為酶解溫度、酶解pH、酶用量、酶解時間，即酶解溫度為主要影響因素，酶解時間影響最小。在考察范圍內(nèi)，最佳工藝條件可選擇為A2B2C2D3，即酶解時間60 min、酶解溫度45 ℃、酶解pH 5.0、酶用量7.2 mg/g。驗證試驗結(jié)果表明，在該條件下，野黃芩苷平均含量為2.42 mg/mL，較原注冊標(biāo)準提取方法（野黃芩苷含量1.34 mg/mL）提高了80.6%。

3 ?結(jié)論

通過對運用纖維素酶法提取制備復(fù)方半邊蓮注射液工藝的探討，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用正交試驗設(shè)計，確定復(fù)方半邊蓮注射液的最佳提取工藝參數(shù)為A2B2C2D3，即酶解時間60 min、酶解溫度45 ℃、酶解pH 5.0、酶用量7.2 mg/g，在此條件下，復(fù)方半邊蓮注射液中野黃芩苷的平均含量為2.42 mg/mL，與注冊標(biāo)準中的煎煮法相比，野黃芩苷含量高出80.6%，提高了有效成分的提取率，而且提取時間由原來3 h縮短至60 min，大大節(jié)約了能源，減少了人工勞動強度，縮短了生產(chǎn)周期，為復(fù)方半邊蓮注射液提取工藝的改進提供了參考依據(jù)。

參考文獻：

[1] 王守英.復(fù)方半邊蓮注射液定性定量標(biāo)準研究察[J].中外健康文摘（醫(yī)藥月刊），2007，4（11）：210-212.

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[4] 何建國，許志強，侯云峰.復(fù)方半邊蓮注射液治療小兒急性支氣管炎98例[J].實用中醫(yī)內(nèi)科雜志，2004，18（4）：366.

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[7] 李鳳君，謝志儒.復(fù)方半邊蓮治療嬰幼兒秋冬季腹瀉臨床觀察[J].中國實用鄉(xiāng)村醫(yī)生雜志，2006，13（5）：43.

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