高陸++王美慧++魏曉雨++曲佳樂(lè)++姜文月

【摘要】目的：確定具有神經(jīng)保護(hù)作用新藥的最佳水提取工藝參數(shù)。方法：采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選最佳工藝，以總皂苷和出膏率為綜合評(píng)分指標(biāo)，優(yōu)選最佳水提取工藝，并對(duì)優(yōu)選工藝進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果：最佳水提取工藝是10倍水，提取3次，每次提取1h。結(jié)論：優(yōu)選后的水提取工藝穩(wěn)定可靠，可為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用該新藥提供參考。

【關(guān)鍵詞】神經(jīng)保護(hù)作用新藥；正交試驗(yàn)；綜合評(píng)分

【中圖分類號(hào)】R2842【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2016）19-0114-03

老年癡呆泛指發(fā)生在65歲以后的各類癡呆，包括阿爾茨海默病、血管性癡呆和混合型癡呆等類型[1]。隨著人口老齡化的加速，老年癡呆的患病率高、疾病負(fù)擔(dān)嚴(yán)重，已成為一個(gè)全球性的公關(guān)衛(wèi)生問(wèn)題，其社會(huì)成本計(jì)劃相當(dāng)于癌癥、心臟病和中風(fēng)成本的總合[2-3]。老年癡呆給患者及家庭帶來(lái)巨大的醫(yī)療、心理和情感壓力，因此從天然藥物中探索開(kāi)發(fā)具有神經(jīng)保護(hù)作用的新藥勢(shì)在必行。

復(fù)方萬(wàn)年青膠囊是由萬(wàn)年青、人參、黃芪等10味中藥組成的純中藥抗癌藥物，具有解毒化瘀、扶正固本的功效。用于肺癌、肝癌、胃癌化療合并用藥，具有減毒增效的作用?；贒rug-similar 概念的復(fù)方抗癌藥新用途開(kāi)發(fā)，通過(guò)連接網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)，將疾病、基因與藥物利用基因表現(xiàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行串連，將藥物處理細(xì)胞后的基因表現(xiàn)圖譜與連接網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)的基因表現(xiàn)圖譜進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)復(fù)方萬(wàn)年青膠囊具有神經(jīng)保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，水提取工藝以總皂苷和出膏率為評(píng)分指標(biāo)，考察料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)工藝的影響，優(yōu)化神經(jīng)保護(hù)作用有效成分最佳提取工藝，為研究具有神經(jīng)保護(hù)作用的新藥工藝開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1儀器與材料

11儀器Ultra-6100型紫外可見(jiàn)分光光度儀（北京普源精電科技有限公司）；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；SB-1200D超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；AB135-S電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）。

12材料人參皂苷Re（批號(hào)：110754-201324，中國(guó)食品藥品檢定研究院），半枝蓮、黃芪、人參均由吉林天力泰藥業(yè)有限公司提供，娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純。

2方法

21水提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)復(fù)方中半枝蓮、黃芪、人參的主要活性成分大多為水溶性物質(zhì)，因此采用傳統(tǒng)水煎煮法進(jìn)行提取，采用L9（34）正交試驗(yàn)（表1）。

綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)計(jì)算方法：（出膏率×03/最大值+總皂苷×07/最大值）×10。

22出膏率考察按處方量稱取半枝蓮、黃芪、人參藥材，混合后加水浸泡1h，按照正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表分別進(jìn)行提取。將所得提取液濃縮、干燥，稱定干膏重量，計(jì)算水提取的干膏得率。

23總皂苷含量測(cè)定

231對(duì)照品溶液制備精密稱取人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)品1198mg于10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為1198mg/mL。

232供試品溶液制備精密稱取所得各干浸膏粉末05g分別置于50mL錐形瓶中，精密加入甲醇30mL，超聲處理20min，放置室溫，過(guò)濾，減壓蒸干甲醇，用15mL蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中。 加乙醚萃取3次（20mL/10mL/5mL），棄去乙醚層。水層加入水飽和正丁醇萃取4次（30mL/20mL/15mL/10mL），合并正丁醇萃取液，用01mol/L的NaOH溶液洗正丁醇層2次，每次10mL，棄去NaOH層，減壓回收正丁醇至干，用甲醇分次洗滌、轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度線，即得供試品溶液。

233標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密量取人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、40、80、120、160、200μL于比色管中，揮干溶劑，加入5%的香草醛醋酸溶液 02mL和高氯酸08mL，在 60℃條件下水浴加熱 15min后，取出，并冷水浴至室溫，精密加入5mL冰醋酸[4]，在544nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以測(cè)得的吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程：Y=49562X-00321（R=09999），結(jié)果顯示人參皂苷Re在48～240μg范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

234測(cè)定方法精密量取供試品溶液02mL置具塞比色管中，水浴揮干溶劑，按上述標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，并測(cè)定吸光度，計(jì)算，即得。

3結(jié)果

31正交試驗(yàn)結(jié)果分析由表2顯示的試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果可直觀分析，極差RC>RA>RB，表明影響該組合物的提取因素主次順序?yàn)椋禾崛〈螖?shù)（C）>料液比（A） >提取時(shí)間（B），各因素不同水平的影響次序?yàn)椋篈3>A2>A1B3>B2>B1C3>C2>C1，因此從上訴實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析其最佳提取工藝為A3B3C3，即加10倍量水，煎煮提取3次，每次2h。

表3所得綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)方差分析結(jié)果顯示，因素C的P<005，表明提取次數(shù)對(duì)提取效率具有顯著性影響，料液比和提取時(shí)間的影響不顯著，為降低成本、節(jié)能減排，故將提取時(shí)間確定為1h。因此，綜合以上分析結(jié)果，最終確定的最佳工藝為A3B2C3，即10倍量水，煎煮提取3次，每次1h。

32驗(yàn)證試驗(yàn)按復(fù)方量稱取藥材5份，按正交試驗(yàn)所選擇的工藝路線，即A3B2C3，即加水10倍量，提取3次，每次1h進(jìn)行提取，計(jì)算干膏平均得率為1954%（n=5，RSD=136%），總皂苷含量為1168mg/g（n=5，RSD=102%）。

4討論

復(fù)方萬(wàn)年青膠囊為多味藥組成的復(fù)方，經(jīng)細(xì)胞親和-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)篩選的結(jié)果表明，該組方中抗老年癡呆活性組分主要包括蒽醌類、黃酮類和皂苷類，細(xì)胞親和-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)篩選的結(jié)果將另行發(fā)表。黃芪中黃芪甲苷在神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用中顯示出重要的作用，黃芪甲苷可以增加周圍神經(jīng)的再生率，增強(qiáng)神經(jīng)元軸突再生和重建[5]，且目前已經(jīng)證實(shí)黃芪甲苷可以提高神經(jīng)元的存活能力[6]；人參皂苷是人參的主要藥理活性成分，它對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)都有作用[7]。半枝蓮的主要成分為黃酮類等，水溶性較好，因此與黃芪、人參一并水提取，水提取路線中以總皂苷和出膏率為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

人參總皂苷是一類含有糖苷鍵的四環(huán)或五環(huán)三萜類化合物，測(cè)定目標(biāo)是四環(huán)三萜或五環(huán)三萜，即皂苷元[8-9]。比色法測(cè)定人參總皂苷的定量原理：皂苷元中的C3和C12上的羥基與香草醛上的醛基發(fā)生反應(yīng)，形成縮醛，成為新的共軛體系而顯色，因此，人參總皂苷的定量測(cè)試應(yīng)符合以下要求：a人參皂苷應(yīng)完全水解成皂苷元；b人參皂苷元結(jié)構(gòu)不被破壞；c皂苷元在一定的濃度范圍與香草醛顯色反應(yīng)呈線性，且所水解下來(lái)的糖對(duì)測(cè)試影響較小。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，筆者嘗試加入3%、5%、7%和10%的香草醛醋酸溶液，隨著香草醛用量的增加，人參總皂苷的吸收有所增加，空白顏色也加深，但是整體凈吸收呈穩(wěn)定趨勢(shì)，說(shuō)明反應(yīng)已達(dá)到飽和，本實(shí)驗(yàn)選擇5%的香草醛醋酸溶液；實(shí)驗(yàn)中考察了加入高氯酸的用量，分別加入04、06、08、10、12mL高氯酸，其中加入04mL和06mL高氯酸時(shí)，吸光度較低，說(shuō)明水解不完全，本實(shí)驗(yàn)選擇加入08mL的高氯酸。

依據(jù)方差分析結(jié)果得知，因素A和因素B的P>005，表明料液比和提取時(shí)間影響不顯著，黃芪、人參和半枝蓮三味藥材中半枝蓮體積大、較吸水，為將藥材充分浸泡，將料液比確定為10倍；另外為降低成本、節(jié)能減排，將提取時(shí)間確定為1h。因素C的P<005，表明提取次數(shù)對(duì)提取效率具有顯著性影響，因此煎煮提取3次。綜合以上分析結(jié)果，最終確定的最佳工藝為10倍量水，煎煮提取3次，每次1h；水提取的干膏平均得率為1954%，總皂苷含量為1168mg/g。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化的提取條件進(jìn)行中試生產(chǎn)，結(jié)果表明本工藝條件適于產(chǎn)品的工業(yè)化，在此條件下，工藝條件溫度，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、均一，表明此工藝條件具有可行性和適用性。

參考文獻(xiàn)

[1] 李錚. 老年癡呆相關(guān)概念辨析 [J]. 中華護(hù)理雜志，2011，46 （10）： 1045.

[2] World Health Organization. Dementia： a public health priority [R]. Geneva： WHO，2012.

[3] Luengo-Femandez R，Leal J， Gray A. Dementia 2010： the prevalence， economic cost and research funding compared with other major diseases[R]. Booklet， Alzheimers Research Trust， 2010.

[4] 萬(wàn)玉華，戴潔，黃春靜，等. 紫外分光光度法測(cè)定參須中的人參總皂苷的含量 [J]. 中國(guó)中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育，2012，10 （24）： 146-147.

[5] 張志國(guó). 黃芪甲苷對(duì)帕金森病神經(jīng)元的保護(hù)作用及其機(jī)制研究 [D]. 西安：第四軍醫(yī)大學(xué)，2012.

[6] 劉德麗，包華音，劉楊. 近5年黃芪化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].食品與藥品，2014，16（1）： 68-70.

[7] 劉紅梅，李瑞雪，楊學(xué)軍，等. 人參皂苷的神經(jīng)保護(hù)作用和機(jī)制及其在神經(jīng)變性疾病中的應(yīng)用[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，31（5）： 595-598.

[8] 楊文志，于淑蓮，婁子恒，等. 論人參總皂苷的科學(xué)定量方法[J].人參研究，2007，2： 7-10.

[9] 孫慕白，金竺. 紅參炮制工藝及質(zhì)量研究[J].長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，30（4）： 611-613.

（編輯：程鵬飛）