陳婧+楊卓

摘要：河豚毒素傳感器響應(yīng)性能與固定化菌體的量和輔料的量都有一定關(guān)系。設(shè)計(jì)微生物量為10 μL，不加輔料及加入1%、2%輔料3種微生物膜，以?shī)A層法固定微生物膜，以氧電極為換能器，分別組裝微生物傳感器，通過(guò)測(cè)定傳感器的線性范圍、線性相關(guān)系數(shù)以及加標(biāo)回收率等獲知固定化膜的通透性的好壞和響應(yīng)信號(hào)的大小，最后確定3種組合中較優(yōu)膜為10 μL菌懸液加入1%的輔料。以最優(yōu)膜組裝毒性傳感器與高效液相色譜方法的對(duì)照發(fā)現(xiàn)兩者的差異不顯著，表明試驗(yàn)建立的毒性微生物傳感器方法可以很好地測(cè)定河豚毒素的毒性。

關(guān)鍵詞：河豚毒素;毒性傳感器;HPLC法;微生物膜

中圖分類號(hào)：S852.4+4 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：0439-8114（2014）20-4952-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.20.048

Biosensor Monitoring Tetrodotoxin with Toxicity Sensor of Different Ratio Microbes

and Comparison with HPLC Methods

CHEN Jing， YANG Zhuo

（Environmental Management College of China， Qinhuangdao 066004， Hebei，China）

Abstract： Tetrodotoxin sensor response performance is closely related with the amount of immobilized bacteria and accessories. Three kinds of microbial membrane were designed. The first one was 10 μL microbial without no accessory material. The second one was 10 μL microbial with 1% accessory material. The third one was 10 μL microbial with 2% accessory material immobilized by sandwich immobilization. A biosensor was fabricated based on oxygen electrode. By measuring the linear range， the linear correlation and the reclaim rate of the two sensor， the property of membrane and value of the response signal was found out. Results showed that 10 microbial with 1% auxiliary materials was the optimal combination of the two membrane. The toxicity sensor was assembled with the optimal membrane and compared with HPLC method. The results showed that the difference between the two methods was not significant. The toxicity microbial sensor method could accurately measure TTX.

Key words： tetrodotoxin; toxicity sensor; HPLC; biofilm

河豚毒素（Tetrodotoxin，簡(jiǎn)稱TTX）是一種強(qiáng)神經(jīng)毒素，目前河豚毒素檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法是小鼠生物測(cè)定法[1]，其他的檢測(cè)方法如高效液相色譜法[2]、免疫學(xué)方法[3]也日漸成熟。微生物傳感器方法[4]由于其方法快捷迅速、價(jià)格低廉，越來(lái)越成為河豚毒素檢測(cè)方法研究的重點(diǎn)。有文獻(xiàn)報(bào)道[5-8]，以地衣芽孢桿菌作為響應(yīng)菌株，采用夾層法制備微生物傳感器測(cè)試其對(duì)河豚毒素的響應(yīng)情況，在濃度10～100 μg/L范圍內(nèi)線性較好。

傳感器響應(yīng)性能與固定化菌體的量和輔料的量都有一定關(guān)系。在提高微生物膜的重現(xiàn)性及測(cè)量范圍的可行性問(wèn)題上設(shè)計(jì)微生物量為10 μL和輔料量分別占濕菌體0%、1%、2% 3種組合的微生物膜的性能測(cè)試。通過(guò)測(cè)定傳感器的線性范圍、線性相關(guān)系數(shù)以及加標(biāo)回收率等獲知固定化膜的通透性的好壞和響應(yīng)信號(hào)的大小，確定菌體和輔料的最佳配比。為了驗(yàn)證地衣芽孢桿菌毒性傳感器性能，將毒性傳感器方法與河豚毒素的高效液相色譜檢測(cè)方法對(duì)比，測(cè)試毒性傳感器測(cè)量的準(zhǔn)確性。

1 ?材料與方法

1.1 ?主要試劑

GGA標(biāo)準(zhǔn)溶液：取質(zhì)量濃度均為150 mg/L的葡萄糖溶液和谷氨酸溶液，等體積混合，溶液中BOD5的質(zhì)量濃度為（198±30.5） mg/L。

試驗(yàn)底液（磷酸鹽緩沖溶液）：分別稱取KH2PO4、Na2HPO4·12H2O 0.4539、5.970 g，用1 200 mL蒸餾水稀釋溶解，pH 7.6。

TTX貯備液：稱量TTX 1.0 mg溶于10.0 mL 的去離子水中，此時(shí)溶液濃度為100 mg/L，濃度較高，較易保存，將此作為TTX貯備溶液，4 ℃保存待用。

TTX標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：由TTX標(biāo)準(zhǔn)貯備液分別稀釋配制成10、20、45、50、75、100 μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

培養(yǎng)基：牛肉膏 0.5 g、蛋白胨 0.5 g、可溶性淀粉 0.5 g、氯化鎂 0.1 g、蒸餾水100 mL，pH 7.0。

醋酸纖維素膜（北京化工學(xué)校附屬工廠）;特快超能膠（漢高粘合劑有限公司）;河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)品（分析純，河北省水產(chǎn)研究所）;甲醇 （色譜純，天津市康科德科技有限公司）;醋酸（色譜純，天津市康科德科技有限公司）;試驗(yàn)所用水為石英二次去離子水。

1.2 ?試驗(yàn)方法

1.2.1 ?固定化微生物膜的制作 ?用微量取液器分別吸取一定配比菌懸液滴在生物膜上，采用夾層法將兩層膜邊粘合起來(lái)，保存以備用。

1.2.2 ?試驗(yàn)流程 ?按圖1組裝河豚毒素毒性傳感器。在35 ℃，pH 7.6，以 GGA質(zhì)量濃度為21.5 mg/L的試驗(yàn)底液穩(wěn)定一段時(shí)間，記錄穩(wěn)定后的電流值I0。然后將一定體積的毒素溶液加入底液中，等待新的平衡，記錄再次穩(wěn)定后的電流值It，通過(guò)試驗(yàn)可知電流的變化ΔI（ΔI=It–I0）與TTX的量成一定比例關(guān)系，得到TTX濃度～ΔI的線性關(guān)系曲線圖。

1.2.3 ?最優(yōu)膜的設(shè)計(jì) ?制備3種組合的微生物膜，組合比例分別為①10 μL濕菌體+0輔料、②10 μL濕菌體+1%輔料③10 μL濕菌體+2%輔料，分別組裝河豚毒素的毒性傳感器。試驗(yàn)條件均為為：35 ℃、pH 7.6，底液中GGA質(zhì)量濃度為21.5 mg/L[5]，進(jìn)行如下3個(gè)試驗(yàn)：

Ⅰ精密度測(cè)試：平行6次測(cè)定傳感器對(duì)質(zhì)量濃度為50 μg/L TTX溶液的響應(yīng)信號(hào)，計(jì)算測(cè)量的平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差及變異系數(shù)。

Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：測(cè)定3種類型毒性微生物傳感器對(duì)不同濃度TTX溶液的響應(yīng)情況，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性響應(yīng)范圍、線性方程及線性相關(guān)系數(shù)。

Ⅲ加標(biāo)回收率試驗(yàn)：取TTX樣品做加標(biāo)回收率試驗(yàn)。

1.2.4 ?高效液相色譜測(cè)試條件的選擇

1）流速的選擇。選擇流動(dòng)相為醋酸和去離子水，設(shè)定總流速為8.000 mL/min，試驗(yàn)醋酸流速為0.799、0.798、0.796、0.792、0.790、0.788、0.785、0.783、0.780 mL/min時(shí)基線穩(wěn)定情況和TTX分離情況。

2）保留時(shí)間。流動(dòng)相為醋酸和去離子水，在上述確定的流速下向液相色譜儀中注射濃度為50、75、100 μg/mL的TTX標(biāo)準(zhǔn)溶液，觀察液相色譜圖，確定其保留時(shí)間。

3）檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇。流動(dòng)相為醋酸和去離子水，在上述確定的流速、保留時(shí)間下測(cè)定波長(zhǎng)分別為220、225、230、235、240 nm 的出峰情況，找到在上述色譜條件下TTX的最大吸收波長(zhǎng)。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?傳感器方法最優(yōu)膜的確定

3個(gè)試驗(yàn)測(cè)試結(jié)果見表1，3種毒性傳感器的響應(yīng)曲線見圖2。如表1及圖2所示，3種固定化方法的線性范圍都在10～80 μg/L之間，線性相關(guān)系數(shù)都在0.96以上;精密度和準(zhǔn)確度都滿足毒性測(cè)量的要求，都可用于微生物傳感器對(duì)河豚毒素的毒性測(cè)試，但是加入1%輔料的微生物膜精密度高于其他配比的膜，線性相關(guān)系數(shù)也比其他配比膜好，制備的微生物膜性能優(yōu)于其他配比的微生物膜，是這3種配比微生物膜中的較優(yōu)膜。10 μL菌懸液加入1%的輔料是制備地衣芽孢桿菌毒性微生物膜過(guò)程中菌液與輔料的最佳配比。

2.2 ?HPLC條件的確定

試驗(yàn)確定高效液相色譜條件為：ODS柱（150 mm×6 mm，5 μm），流動(dòng)相為醋酸和去離子水，醋酸流速為0.798 mL/min，去離子水流速為0.002 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm;TTX保留時(shí)間為8.5 min;室溫。

2.3 ?HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線

配制濃度分別為10、20、45、50、75 100 μg/mL TTX系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“2.2”的色譜條件，各進(jìn)樣10 μL，記錄在此色譜條件下各系列標(biāo)準(zhǔn)毒素的峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，河豚毒素濃度為橫坐標(biāo)，繪制高效液相色譜法測(cè)定河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。如圖3所示，TTX在濃度20～100 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性回歸方程為y=680.93x-4 544.20，相關(guān)系數(shù)為0.995 6。

2.4 ?兩種測(cè)試方法結(jié)果比較

在“2.2”確定的色譜條件下向液相色譜儀中注射10 μL未知濃度的TTX樣品，測(cè)定未知樣品的峰面積，利用圖3的標(biāo)準(zhǔn)曲線y=680.93x-4 544.20計(jì)算出樣品濃度;以最優(yōu)膜組裝毒性傳感器，試驗(yàn)測(cè)得未知樣品稀釋1 000倍后電流差值△I，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.002 5x+0.012 2，由此可以計(jì)算出稀釋后的樣品濃度，兩種測(cè)定方法對(duì)同一未知樣品的測(cè)定結(jié)果見表2。兩種測(cè)定方法的結(jié)果用SPSS軟件進(jìn)行顯著性t檢驗(yàn)，可知P>0.05，兩者的差異不顯著，兩種測(cè)定方法對(duì)樣品的測(cè)定結(jié)果有很好的一致性。

3 ?小結(jié)與討論

試驗(yàn)測(cè)試了10 μL菌懸液加入0%、1%、2%3種微生物組裝的傳感器對(duì)河豚毒素的響應(yīng)，結(jié)果表明，這3種微生物傳感器都可滿足微生物傳感器測(cè)試毒性的要求，10 μL地衣芽孢桿菌菌懸液加入1%輔料制膜組裝的傳感器性能最優(yōu)。在實(shí)驗(yàn)室自有的條件下，利用高效液相色譜法測(cè)定TTX的毒性，通過(guò)試驗(yàn)得到最佳的色譜條件為：分析柱為ODS柱（150 mm×6 mm，5 μm），流動(dòng)相：醋酸和去離子水，流速分別為0.798 mL/min和0.002 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm;TTX保留時(shí)間為8.5 min;室溫;在此色譜條件下，測(cè)得TTX濃度在20～100 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性回歸方程為y=680.93x-4 544.20，相關(guān)系數(shù)為0.995 6。同時(shí)利用課題裝的地衣芽孢桿菌毒性微生物傳感器和高效液相色譜法測(cè)定未知濃度的TTX的毒性。通過(guò)結(jié)果對(duì)比，高效液相色譜法與微生物傳感器的測(cè)定結(jié)果有很好的一致性，試驗(yàn)建立的微生物傳感器方法可以很好的測(cè)定河豚毒素濃度，但是仍有許多不足之處有待進(jìn)一步研究，比如傳感器的穩(wěn)定性和響應(yīng)范圍，微生物膜固定化技術(shù)的優(yōu)化等，可以作為下一階段研究的重點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

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TTX標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：由TTX標(biāo)準(zhǔn)貯備液分別稀釋配制成10、20、45、50、75、100 μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

培養(yǎng)基：牛肉膏 0.5 g、蛋白胨 0.5 g、可溶性淀粉 0.5 g、氯化鎂 0.1 g、蒸餾水100 mL，pH 7.0。

醋酸纖維素膜（北京化工學(xué)校附屬工廠）;特快超能膠（漢高粘合劑有限公司）;河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)品（分析純，河北省水產(chǎn)研究所）;甲醇 （色譜純，天津市康科德科技有限公司）;醋酸（色譜純，天津市康科德科技有限公司）;試驗(yàn)所用水為石英二次去離子水。

1.2 ?試驗(yàn)方法

1.2.1 ?固定化微生物膜的制作 ?用微量取液器分別吸取一定配比菌懸液滴在生物膜上，采用夾層法將兩層膜邊粘合起來(lái)，保存以備用。

1.2.2 ?試驗(yàn)流程 ?按圖1組裝河豚毒素毒性傳感器。在35 ℃，pH 7.6，以 GGA質(zhì)量濃度為21.5 mg/L的試驗(yàn)底液穩(wěn)定一段時(shí)間，記錄穩(wěn)定后的電流值I0。然后將一定體積的毒素溶液加入底液中，等待新的平衡，記錄再次穩(wěn)定后的電流值It，通過(guò)試驗(yàn)可知電流的變化ΔI（ΔI=It–I0）與TTX的量成一定比例關(guān)系，得到TTX濃度～ΔI的線性關(guān)系曲線圖。

1.2.3 ?最優(yōu)膜的設(shè)計(jì) ?制備3種組合的微生物膜，組合比例分別為①10 μL濕菌體+0輔料、②10 μL濕菌體+1%輔料③10 μL濕菌體+2%輔料，分別組裝河豚毒素的毒性傳感器。試驗(yàn)條件均為為：35 ℃、pH 7.6，底液中GGA質(zhì)量濃度為21.5 mg/L[5]，進(jìn)行如下3個(gè)試驗(yàn)：

Ⅰ精密度測(cè)試：平行6次測(cè)定傳感器對(duì)質(zhì)量濃度為50 μg/L TTX溶液的響應(yīng)信號(hào)，計(jì)算測(cè)量的平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差及變異系數(shù)。

Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：測(cè)定3種類型毒性微生物傳感器對(duì)不同濃度TTX溶液的響應(yīng)情況，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性響應(yīng)范圍、線性方程及線性相關(guān)系數(shù)。

Ⅲ加標(biāo)回收率試驗(yàn)：取TTX樣品做加標(biāo)回收率試驗(yàn)。

1.2.4 ?高效液相色譜測(cè)試條件的選擇

1）流速的選擇。選擇流動(dòng)相為醋酸和去離子水，設(shè)定總流速為8.000 mL/min，試驗(yàn)醋酸流速為0.799、0.798、0.796、0.792、0.790、0.788、0.785、0.783、0.780 mL/min時(shí)基線穩(wěn)定情況和TTX分離情況。

2）保留時(shí)間。流動(dòng)相為醋酸和去離子水，在上述確定的流速下向液相色譜儀中注射濃度為50、75、100 μg/mL的TTX標(biāo)準(zhǔn)溶液，觀察液相色譜圖，確定其保留時(shí)間。

3）檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇。流動(dòng)相為醋酸和去離子水，在上述確定的流速、保留時(shí)間下測(cè)定波長(zhǎng)分別為220、225、230、235、240 nm 的出峰情況，找到在上述色譜條件下TTX的最大吸收波長(zhǎng)。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?傳感器方法最優(yōu)膜的確定

3個(gè)試驗(yàn)測(cè)試結(jié)果見表1，3種毒性傳感器的響應(yīng)曲線見圖2。如表1及圖2所示，3種固定化方法的線性范圍都在10～80 μg/L之間，線性相關(guān)系數(shù)都在0.96以上;精密度和準(zhǔn)確度都滿足毒性測(cè)量的要求，都可用于微生物傳感器對(duì)河豚毒素的毒性測(cè)試，但是加入1%輔料的微生物膜精密度高于其他配比的膜，線性相關(guān)系數(shù)也比其他配比膜好，制備的微生物膜性能優(yōu)于其他配比的微生物膜，是這3種配比微生物膜中的較優(yōu)膜。10 μL菌懸液加入1%的輔料是制備地衣芽孢桿菌毒性微生物膜過(guò)程中菌液與輔料的最佳配比。

2.2 ?HPLC條件的確定

試驗(yàn)確定高效液相色譜條件為：ODS柱（150 mm×6 mm，5 μm），流動(dòng)相為醋酸和去離子水，醋酸流速為0.798 mL/min，去離子水流速為0.002 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm;TTX保留時(shí)間為8.5 min;室溫。

2.3 ?HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線

配制濃度分別為10、20、45、50、75 100 μg/mL TTX系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“2.2”的色譜條件，各進(jìn)樣10 μL，記錄在此色譜條件下各系列標(biāo)準(zhǔn)毒素的峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，河豚毒素濃度為橫坐標(biāo)，繪制高效液相色譜法測(cè)定河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。如圖3所示，TTX在濃度20～100 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性回歸方程為y=680.93x-4 544.20，相關(guān)系數(shù)為0.995 6。

2.4 ?兩種測(cè)試方法結(jié)果比較

在“2.2”確定的色譜條件下向液相色譜儀中注射10 μL未知濃度的TTX樣品，測(cè)定未知樣品的峰面積，利用圖3的標(biāo)準(zhǔn)曲線y=680.93x-4 544.20計(jì)算出樣品濃度;以最優(yōu)膜組裝毒性傳感器，試驗(yàn)測(cè)得未知樣品稀釋1 000倍后電流差值△I，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.002 5x+0.012 2，由此可以計(jì)算出稀釋后的樣品濃度，兩種測(cè)定方法對(duì)同一未知樣品的測(cè)定結(jié)果見表2。兩種測(cè)定方法的結(jié)果用SPSS軟件進(jìn)行顯著性t檢驗(yàn)，可知P>0.05，兩者的差異不顯著，兩種測(cè)定方法對(duì)樣品的測(cè)定結(jié)果有很好的一致性。

3 ?小結(jié)與討論

試驗(yàn)測(cè)試了10 μL菌懸液加入0%、1%、2%3種微生物組裝的傳感器對(duì)河豚毒素的響應(yīng)，結(jié)果表明，這3種微生物傳感器都可滿足微生物傳感器測(cè)試毒性的要求，10 μL地衣芽孢桿菌菌懸液加入1%輔料制膜組裝的傳感器性能最優(yōu)。在實(shí)驗(yàn)室自有的條件下，利用高效液相色譜法測(cè)定TTX的毒性，通過(guò)試驗(yàn)得到最佳的色譜條件為：分析柱為ODS柱（150 mm×6 mm，5 μm），流動(dòng)相：醋酸和去離子水，流速分別為0.798 mL/min和0.002 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm;TTX保留時(shí)間為8.5 min;室溫;在此色譜條件下，測(cè)得TTX濃度在20～100 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性回歸方程為y=680.93x-4 544.20，相關(guān)系數(shù)為0.995 6。同時(shí)利用課題裝的地衣芽孢桿菌毒性微生物傳感器和高效液相色譜法測(cè)定未知濃度的TTX的毒性。通過(guò)結(jié)果對(duì)比，高效液相色譜法與微生物傳感器的測(cè)定結(jié)果有很好的一致性，試驗(yàn)建立的微生物傳感器方法可以很好的測(cè)定河豚毒素濃度，但是仍有許多不足之處有待進(jìn)一步研究，比如傳感器的穩(wěn)定性和響應(yīng)范圍，微生物膜固定化技術(shù)的優(yōu)化等，可以作為下一階段研究的重點(diǎn)。

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TTX標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：由TTX標(biāo)準(zhǔn)貯備液分別稀釋配制成10、20、45、50、75、100 μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

培養(yǎng)基：牛肉膏 0.5 g、蛋白胨 0.5 g、可溶性淀粉 0.5 g、氯化鎂 0.1 g、蒸餾水100 mL，pH 7.0。

醋酸纖維素膜（北京化工學(xué)校附屬工廠）;特快超能膠（漢高粘合劑有限公司）;河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)品（分析純，河北省水產(chǎn)研究所）;甲醇 （色譜純，天津市康科德科技有限公司）;醋酸（色譜純，天津市康科德科技有限公司）;試驗(yàn)所用水為石英二次去離子水。

1.2 ?試驗(yàn)方法

1.2.1 ?固定化微生物膜的制作 ?用微量取液器分別吸取一定配比菌懸液滴在生物膜上，采用夾層法將兩層膜邊粘合起來(lái)，保存以備用。

1.2.2 ?試驗(yàn)流程 ?按圖1組裝河豚毒素毒性傳感器。在35 ℃，pH 7.6，以 GGA質(zhì)量濃度為21.5 mg/L的試驗(yàn)底液穩(wěn)定一段時(shí)間，記錄穩(wěn)定后的電流值I0。然后將一定體積的毒素溶液加入底液中，等待新的平衡，記錄再次穩(wěn)定后的電流值It，通過(guò)試驗(yàn)可知電流的變化ΔI（ΔI=It–I0）與TTX的量成一定比例關(guān)系，得到TTX濃度～ΔI的線性關(guān)系曲線圖。

1.2.3 ?最優(yōu)膜的設(shè)計(jì) ?制備3種組合的微生物膜，組合比例分別為①10 μL濕菌體+0輔料、②10 μL濕菌體+1%輔料③10 μL濕菌體+2%輔料，分別組裝河豚毒素的毒性傳感器。試驗(yàn)條件均為為：35 ℃、pH 7.6，底液中GGA質(zhì)量濃度為21.5 mg/L[5]，進(jìn)行如下3個(gè)試驗(yàn)：

Ⅰ精密度測(cè)試：平行6次測(cè)定傳感器對(duì)質(zhì)量濃度為50 μg/L TTX溶液的響應(yīng)信號(hào)，計(jì)算測(cè)量的平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差及變異系數(shù)。

Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：測(cè)定3種類型毒性微生物傳感器對(duì)不同濃度TTX溶液的響應(yīng)情況，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性響應(yīng)范圍、線性方程及線性相關(guān)系數(shù)。

Ⅲ加標(biāo)回收率試驗(yàn)：取TTX樣品做加標(biāo)回收率試驗(yàn)。

1.2.4 ?高效液相色譜測(cè)試條件的選擇

1）流速的選擇。選擇流動(dòng)相為醋酸和去離子水，設(shè)定總流速為8.000 mL/min，試驗(yàn)醋酸流速為0.799、0.798、0.796、0.792、0.790、0.788、0.785、0.783、0.780 mL/min時(shí)基線穩(wěn)定情況和TTX分離情況。

2）保留時(shí)間。流動(dòng)相為醋酸和去離子水，在上述確定的流速下向液相色譜儀中注射濃度為50、75、100 μg/mL的TTX標(biāo)準(zhǔn)溶液，觀察液相色譜圖，確定其保留時(shí)間。

3）檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇。流動(dòng)相為醋酸和去離子水，在上述確定的流速、保留時(shí)間下測(cè)定波長(zhǎng)分別為220、225、230、235、240 nm 的出峰情況，找到在上述色譜條件下TTX的最大吸收波長(zhǎng)。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?傳感器方法最優(yōu)膜的確定

3個(gè)試驗(yàn)測(cè)試結(jié)果見表1，3種毒性傳感器的響應(yīng)曲線見圖2。如表1及圖2所示，3種固定化方法的線性范圍都在10～80 μg/L之間，線性相關(guān)系數(shù)都在0.96以上;精密度和準(zhǔn)確度都滿足毒性測(cè)量的要求，都可用于微生物傳感器對(duì)河豚毒素的毒性測(cè)試，但是加入1%輔料的微生物膜精密度高于其他配比的膜，線性相關(guān)系數(shù)也比其他配比膜好，制備的微生物膜性能優(yōu)于其他配比的微生物膜，是這3種配比微生物膜中的較優(yōu)膜。10 μL菌懸液加入1%的輔料是制備地衣芽孢桿菌毒性微生物膜過(guò)程中菌液與輔料的最佳配比。

2.2 ?HPLC條件的確定

試驗(yàn)確定高效液相色譜條件為：ODS柱（150 mm×6 mm，5 μm），流動(dòng)相為醋酸和去離子水，醋酸流速為0.798 mL/min，去離子水流速為0.002 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm;TTX保留時(shí)間為8.5 min;室溫。

2.3 ?HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線

配制濃度分別為10、20、45、50、75 100 μg/mL TTX系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“2.2”的色譜條件，各進(jìn)樣10 μL，記錄在此色譜條件下各系列標(biāo)準(zhǔn)毒素的峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，河豚毒素濃度為橫坐標(biāo)，繪制高效液相色譜法測(cè)定河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。如圖3所示，TTX在濃度20～100 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性回歸方程為y=680.93x-4 544.20，相關(guān)系數(shù)為0.995 6。

2.4 ?兩種測(cè)試方法結(jié)果比較

在“2.2”確定的色譜條件下向液相色譜儀中注射10 μL未知濃度的TTX樣品，測(cè)定未知樣品的峰面積，利用圖3的標(biāo)準(zhǔn)曲線y=680.93x-4 544.20計(jì)算出樣品濃度;以最優(yōu)膜組裝毒性傳感器，試驗(yàn)測(cè)得未知樣品稀釋1 000倍后電流差值△I，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.002 5x+0.012 2，由此可以計(jì)算出稀釋后的樣品濃度，兩種測(cè)定方法對(duì)同一未知樣品的測(cè)定結(jié)果見表2。兩種測(cè)定方法的結(jié)果用SPSS軟件進(jìn)行顯著性t檢驗(yàn)，可知P>0.05，兩者的差異不顯著，兩種測(cè)定方法對(duì)樣品的測(cè)定結(jié)果有很好的一致性。

3 ?小結(jié)與討論

試驗(yàn)測(cè)試了10 μL菌懸液加入0%、1%、2%3種微生物組裝的傳感器對(duì)河豚毒素的響應(yīng)，結(jié)果表明，這3種微生物傳感器都可滿足微生物傳感器測(cè)試毒性的要求，10 μL地衣芽孢桿菌菌懸液加入1%輔料制膜組裝的傳感器性能最優(yōu)。在實(shí)驗(yàn)室自有的條件下，利用高效液相色譜法測(cè)定TTX的毒性，通過(guò)試驗(yàn)得到最佳的色譜條件為：分析柱為ODS柱（150 mm×6 mm，5 μm），流動(dòng)相：醋酸和去離子水，流速分別為0.798 mL/min和0.002 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm;TTX保留時(shí)間為8.5 min;室溫;在此色譜條件下，測(cè)得TTX濃度在20～100 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性回歸方程為y=680.93x-4 544.20，相關(guān)系數(shù)為0.995 6。同時(shí)利用課題裝的地衣芽孢桿菌毒性微生物傳感器和高效液相色譜法測(cè)定未知濃度的TTX的毒性。通過(guò)結(jié)果對(duì)比，高效液相色譜法與微生物傳感器的測(cè)定結(jié)果有很好的一致性，試驗(yàn)建立的微生物傳感器方法可以很好的測(cè)定河豚毒素濃度，但是仍有許多不足之處有待進(jìn)一步研究，比如傳感器的穩(wěn)定性和響應(yīng)范圍，微生物膜固定化技術(shù)的優(yōu)化等，可以作為下一階段研究的重點(diǎn)。

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