李莉玲

（廣東惠州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)系，廣東 惠州 516005）

巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）是19世紀(jì)80年代初期發(fā)展起來(lái)的一種新型的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，在生物表達(dá)系統(tǒng)中研究最為廣泛。巴斯德畢赤酵母具有易于高密度發(fā)酵、培養(yǎng)基成本低、外源基因整合穩(wěn)定、外源蛋白以分泌蛋白形式存在、內(nèi)生蛋白較少，以及蛋白翻譯后真核加工等優(yōu)點(diǎn)。該系統(tǒng)相較其他表達(dá)系統(tǒng)而言，彌補(bǔ)了大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)不易表達(dá)復(fù)雜蛋白的限制以及植物、動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)周期長(zhǎng)、操作繁瑣、成本高的缺點(diǎn)，完善了釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）分泌效率低、表達(dá)菌株不夠穩(wěn)定、表達(dá)質(zhì)粒易丟失等缺陷，迅速成為各國(guó)科學(xué)工作者的研究熱點(diǎn)。

但是人們也發(fā)現(xiàn)了巴斯德畢赤酵母外源表達(dá)系統(tǒng)的不足。在表達(dá)外源蛋白時(shí)，巴斯德畢赤酵母重組菌往往存在比較嚴(yán)重的蛋白降解現(xiàn)象。酵母表達(dá)外源糖蛋白時(shí)會(huì)對(duì)蛋白進(jìn)行過(guò)度N-糖基化修飾，產(chǎn)生高甘露糖型糖鏈，影響蛋白的活性，從而限制了巴斯德畢赤酵母表達(dá)人源型蛋白表達(dá)在醫(yī)藥方面的應(yīng)用。隨著2009年巴斯德畢赤酵母全基因組測(cè)序和注釋工作的完成，人們對(duì)影響其轉(zhuǎn)錄調(diào)控、表達(dá)調(diào)控及翻譯后修飾等機(jī)理有了進(jìn)一步的了解，可以通過(guò)相關(guān)基因的敲除達(dá)到影響表達(dá)蛋白途徑，從而實(shí)現(xiàn)改良的畢赤酵母重組菌的構(gòu)建。

巴斯德畢赤酵母中常用的直接基因缺失的方法主要分為兩類：有標(biāo)記的插入替換方法和無(wú)標(biāo)記的Pop-In/Pop-Out方法［1］。

1 有標(biāo)記的插入替換方法

有標(biāo)記的插入替換方法以抗性基因作為篩選標(biāo)記，在抗性基因片段兩邊通過(guò)PCR 擴(kuò)增接上被敲除基因在宿主基因兩邊的同源片段。將兩端連有同源片段的抗性基因通過(guò)雙酶切后連入載體質(zhì)粒。以該重組質(zhì)粒為模板得到兩端連有同源片段的抗性基因重組片段，整合到宿主菌體內(nèi)，發(fā)生同源重組，導(dǎo)致插入的抗性基因替換掉宿主染色體上的目的基因，從而實(shí)現(xiàn)目的基因的敲除。

圖1 基因直接插入替換原理圖[1]

華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的倪振華等人采用sh ble抗性基因作為篩選標(biāo)記，采用插入替換的方法構(gòu)建Polycomb Repressive Complex 1（PRC1）基因缺失菌株。方法原理見(jiàn)圖1。其中圖中的右斜線代表基因的5’序列，左斜線代表PRC1基因的3’序列。

最后將電轉(zhuǎn)化后的菌液涂布在Zeocin（博來(lái)霉素）抗性平板上，30℃培養(yǎng)兩到三天，挑選轉(zhuǎn)化子進(jìn)行不同部位引物的PCR鑒定，最后證實(shí)PRC1基因缺失。

圖2 PCR鑒定原理圖[1]

2 無(wú)標(biāo)記的Pop-In/Pop-Out方法

2001年Soderholm 構(gòu)建了一個(gè)通過(guò)Pop-In/Pop-Out 實(shí)現(xiàn)巴斯德畢赤酵母基因取代的載體pPOP（5544bp）［2］。該載體含有一個(gè)T-urf13標(biāo)記基因以及與腺嘌呤生產(chǎn)有關(guān)的ARG4基因。把目的基因接入多克隆位點(diǎn)，然后轉(zhuǎn)入宿主菌體內(nèi)，發(fā)生兩次同源重組，實(shí)現(xiàn)了目的基因到宿主菌基因組的無(wú)標(biāo)記性整合。為基因的無(wú)標(biāo)記敲除提供了思路和方法。

第一個(gè)是使用尿嘧啶生物合成基因，如URA3和URA5作為反向篩選標(biāo)記，同時(shí)利用表達(dá)野生型的尿嘧啶生物合成基因的細(xì)胞不能在含有5-氟乳清酸存在下生長(zhǎng)而進(jìn)行篩選。第二個(gè)方法，同樣基于反向篩選標(biāo)記，引入來(lái)自T-urf13雄性不育玉米的線粒體基因組作為反向篩選標(biāo)記，當(dāng)滅多蟲存在的時(shí)候反向篩選。另一個(gè)是Cre-loxP重組系統(tǒng)，兩個(gè)loxP位點(diǎn)（loxP71、loxP66）連在標(biāo)志基因的兩側(cè)，在Cre重組酶的表達(dá)下，兩個(gè)loxP位點(diǎn)有效地重組變成單個(gè)loxP，從而導(dǎo)致標(biāo)記基因被刪除。這三種方法各有自己的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，已成為巴斯德畢赤酵母兩步基因重組敲除基因的常用的方法。

2.1 URA3作為反向篩選標(biāo)記

URA5可作為反向篩選標(biāo)記，而且已經(jīng)被用于構(gòu)建一系列整合載體，實(shí)現(xiàn)畢赤酵母的基因穩(wěn)定改造［3］。

URA3作為反向篩選標(biāo)記的Pop-In/Pop-Out方法，主要是利用了URA3基因所編碼的酶是尿嘧啶合成的關(guān)鍵酶，該酶能把5-FOA（5-氟乳清酸）轉(zhuǎn)化成對(duì)細(xì)胞有毒的物質(zhì)，使得帶有URA3基因的菌株不能在含有5-FOA的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而缺失URA3基因的酵母則不能在尿嘧啶缺陷的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。

一般的方法是將一個(gè)帶兩個(gè)標(biāo)記基因（URA3以及兩端含被敲除基因同源臂的編碼營(yíng)養(yǎng)物的基因，以ADE為例）的Pop-In/Pop-Out載體通過(guò)同源重組轉(zhuǎn)入相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型的畢赤酵母菌株，通過(guò)兩次同源重組實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因敲除。第一次重組后兩個(gè)標(biāo)記基因都進(jìn)入畢赤酵母染色體，此時(shí)可用含有5-FOA的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。然后將不能在5-FOA的培養(yǎng)基生長(zhǎng)的重組菌在豐富培養(yǎng)基中培養(yǎng)擴(kuò)增，其中一些重組菌由于染色體中重復(fù)的兩個(gè)同源臂序列之間發(fā)生同源交換，導(dǎo)致染色體上包括URA基因在內(nèi)的敲除質(zhì)粒骨架序列的切除以及重復(fù)區(qū)段中兩個(gè)拷貝之一的丟失，即發(fā)生了二次重組。二次重組可能產(chǎn)生兩種菌：不含兩種篩選標(biāo)記基因的野生型菌株與保留了ADE基因的成功敲除目的基因的重組菌。最后通腺嘌呤缺陷的含5-FOA的培養(yǎng)基進(jìn)行二次篩選，得到敲除成功的菌株。原理如圖3所示。

圖3 URA3作為反向篩選標(biāo)記的Pop-in/Pop-out方法[4]

圖中敲除質(zhì)粒的ADE1基因可根據(jù)被敲除菌株的特性替換成相應(yīng)的標(biāo)記基因，其起到輔助篩選的作用，可大大降低篩選的工作量，提高篩選突變株的效率。而URA3是一個(gè)不可替代的關(guān)鍵性篩選標(biāo)記，可作為一種正負(fù)篩選標(biāo)記使用。在插入ADE1基因的位置上也可以不引入篩選標(biāo)記基因，只利用URA3單個(gè)篩選標(biāo)記利用兩步置換的方法在敲除目標(biāo)基因是可行的，但是這種方法在篩選突變株時(shí)會(huì)增加篩選的工作量。

利用URA3作為反向篩選標(biāo)記兩步重組敲除基因的方法有一個(gè)缺點(diǎn)：即使是在提供了尿嘧啶的培養(yǎng)基里，巴斯德畢赤酵母尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株依然生長(zhǎng)得很慢。這可能是因?yàn)槟蜞奏I(yíng)養(yǎng)缺陷型的巴斯德畢赤酵母不能很好地利用培養(yǎng)基里的尿嘧啶。由于生長(zhǎng)緩慢的限制，這樣的菌株很難作為生產(chǎn)工程菌在工業(yè)上的廣泛應(yīng)用。

2.2 T-urf13（專化玉米T型胞質(zhì)不育基因）作為反向篩選標(biāo)記

來(lái)自雄性不育玉米的線粒體基因組的T-urf13 基因，編碼一個(gè)賦予細(xì)胞T-型雄性不育特性的13-kD 的多肽［5］。早前的研究發(fā)現(xiàn)含該基因的釀酒酵母重組菌細(xì)胞對(duì)殺蟲劑滅多蟲很敏感，同時(shí)在普通的生長(zhǎng)條件下該重組菌幾乎不體現(xiàn)任何生長(zhǎng)受抑制的現(xiàn)象，并且這一發(fā)現(xiàn)在巴斯德畢赤酵母身上也非常相似［2］。因而條件致死的T-urf13基因可作為替代URA3的反向篩選標(biāo)記，避免了生長(zhǎng)緩慢的尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型巴斯德畢赤酵母重組菌的產(chǎn)生，得到二次重組后的基因敲除菌。

這一方法也是先構(gòu)建一個(gè)含T-urf13基因與正向篩選標(biāo)記基因的敲除質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)入畢赤酵母重組菌中。再利用正向篩選標(biāo)記篩選得到第一次重組成功的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，并將其在含methomyl的培養(yǎng)基進(jìn)行反向篩選。載體上的T-urf13反向篩選標(biāo)記使菌株在滅多蟲平板上致死。同時(shí)，在這種致死壓力下，宿主為了存活下來(lái)，迫使插入載體在內(nèi)部發(fā)生雙交換同源重組，去除插入載體［6］。只有去除了插入載體的重組菌才能在methomyl 平板上存活。原理圖如下所示：

圖4 T-urf13作為反向篩選標(biāo)記的Pop-in/Pop-out[1]

圖中的正向篩選標(biāo)記sh ble基因可用其他正向篩選標(biāo)記替代。

然而，T-urf13基因的毒性使得轉(zhuǎn)化的菌株很少能存活，并因某些基因被刪除可能導(dǎo)致條件致死，從而限制了該方法的推廣使用。

2.3 Cre-loxP重組系統(tǒng)

Cre-loxP重組系統(tǒng)在釀酒酵母中已經(jīng)使用得比較成熟，2008年被作為一種快速和方便的實(shí)現(xiàn)無(wú)標(biāo)記基因刪除的方法在在巴斯德畢赤酵母中應(yīng)用。

Cre/mutated lox 系統(tǒng)、Zeocin 抗性標(biāo)記和同源臂通過(guò)融合PCR 被疊接在一起，構(gòu)成基因刪除盒子（同源區(qū)域-lox71-Cre-ZeoR-lox66-同源區(qū)域），這個(gè)能通過(guò)同源重組整合到巴斯德畢赤酵母基因組上。把雙交換的重組子轉(zhuǎn)移到甲醇誘導(dǎo)的培養(yǎng)基后，Cre 重組酶的瞬時(shí)表達(dá)導(dǎo)致lox71-Cre-ZeoR-lox66 片段變成一個(gè)雙突變的lox72 位點(diǎn)的重組反應(yīng)，從而從巴斯德畢赤酵母基因組中刪了Cre-ZeoR盒子。原理圖如下：

圖5 （a）Cre-loxP系統(tǒng).（b）Cre-ZeoR盒子.（c）該非標(biāo)記的基因刪除策略.[7]

Cre-loxP重組系統(tǒng)已被成功用于引起單基因或者雙基因的刪除。2011年，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)的研究人員在巴斯德畢赤酵母基因組里用進(jìn)行了HIS4基因的成功敲除，并在這個(gè)重組菌的基礎(chǔ)上進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)PEP4基因的敲除［6］。而且二次敲除中，前次留下的雙突變lox72位點(diǎn)沒(méi)有影響后來(lái)引入的刪除盒l(wèi)ox71與lox66之間的在Cre重組酶調(diào)節(jié)的重組。

近年來(lái)，Cre-loxP重組系統(tǒng)已經(jīng)被廣泛用于多種生物體里。38-kDa的Cre蛋白催化兩個(gè)loxP位點(diǎn)之間的輔助因子獨(dú)立的重組。當(dāng)兩個(gè)loxP位點(diǎn)被放置相同的方向，Cre介導(dǎo)的重組可以刪除他們側(cè)面的基因序列，同時(shí)留下一個(gè)loxP在后面。然而，當(dāng)反復(fù)地使用這系統(tǒng)在同一基因背景里，一個(gè)共同的關(guān)注點(diǎn)是可能的重組會(huì)發(fā)生在新引進(jìn)的loxP位點(diǎn)和前面的留在基因組里loxP位點(diǎn)。為了解決這個(gè)難題，突變loxP片段被產(chǎn)生。特別流行的是lox71和lox66，每一個(gè)都包含著一個(gè)5-bp改變?cè)诨匚男蛄?。lox71和lox66的重組導(dǎo)致一個(gè)天然的loxP位點(diǎn)和一個(gè)雙突變的lox72位點(diǎn)。留在在染色體上的雙突變的lox72位點(diǎn)對(duì)Cre重組酶顯示出著強(qiáng)還原的結(jié)合能力，同時(shí)幾乎不參加序列重組。所以這個(gè)方法可以被連續(xù)地用來(lái)中斷巴斯德畢赤酵母的基因，而不需要引入篩選標(biāo)記。

2.4 另一種Pop-In/Pop-Out方法

利用反向篩選標(biāo)記的兩步法同源重組實(shí)現(xiàn)畢赤酵母基因敲除的方法，都是基于敲除質(zhì)粒的構(gòu)建去引入同源臂，然后在生長(zhǎng)壓力條件下，利用兩拷貝同源臂之間的相同序列實(shí)現(xiàn)二次重組，再利用標(biāo)記基因篩選出基因敲除后的重組菌。為了提高篩選效率，常根據(jù)被敲除的宿主菌的性質(zhì)同時(shí)引入一個(gè)正向篩選標(biāo)記，進(jìn)行正反向篩選。URA3基因與T-urf13基因是兩個(gè)常用作Pop-In/Pop-Out方法里的反向篩選標(biāo)記，但由于它們分別給重組畢赤酵母帶來(lái)的生長(zhǎng)緩慢以及毒性導(dǎo)致的低存活率都限制了這兩種反向標(biāo)記實(shí)現(xiàn)非標(biāo)記敲除基因方法的應(yīng)用。

大腸桿菌的mazF 作為一種新的反向篩選標(biāo)志被用于巴斯德畢赤酵母的Pop-In/Pop-Out 敲除基因［8］。mazF編碼一個(gè)毒素MazF，這是一個(gè)重要的毒素-抗血清系統(tǒng)，介導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡。MazF作為一種mRNA干擾酶，會(huì)優(yōu)先切斷在ACA（特定序列）上的單鏈mRNA以阻止蛋白合成，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)阻遏［9］。

mazF基因被放置在誘導(dǎo)的表達(dá)系統(tǒng)里，同時(shí)Zeocin抗性基因作為一個(gè)正向的篩選標(biāo)志。但是一般用于在功能基因片段中插入一段序列，以破壞該基因的正常轉(zhuǎn)錄與翻譯，從而實(shí)現(xiàn)基因的功能缺失。

3 位點(diǎn)特異性的核酸酶系統(tǒng)

近十年來(lái)發(fā)展了一種新的研究手段，可以對(duì)各種細(xì)胞和各種生物體內(nèi)的幾乎任意基因進(jìn)行人工操作，這種新技術(shù)被稱為“基因組編輯技術(shù)（genome editing）”，由序列特異性的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與非特異性的DNA切割結(jié)構(gòu)域組合而成的人工核酸酶就是基因組編輯技術(shù)的重要組成部分。這些嵌合式的核酸酶能夠以極高的效率、極高的精確度對(duì)基因組進(jìn)行人工修飾［10］。

ZFN（鋅指核糖核酸酶，Zinc-finger nucleases）是由FokI 限制性核酸內(nèi)切酶當(dāng)中的非特異性的DNA 切割結(jié)構(gòu)域和鋅指蛋白（zinc-nger protein）組合而成的。ZFN 二聚體（dimers）能夠促使DNA 斷裂形成DSB（double-strand breaks，DNA雙鏈斷裂缺口），，進(jìn)而誘發(fā)DSB修復(fù)機(jī)制。鋅指結(jié)構(gòu)域的靶向功能使ZFN能夠?qū)蚪M中的特定位點(diǎn)進(jìn)行定向改造。TALEN（轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶，transcription activator-like effector nuclease）主要由Fok I內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域和TALE蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域組合而成。TALE蛋白含有多個(gè)33-35個(gè)氨基酸組成的重復(fù)肽段，而每一個(gè)肽段都能夠識(shí)別一個(gè)堿基。與ZFN 一樣，TALEN 也能使DNA 靶序列斷裂，形成DSB，進(jìn)而激活DNA損傷修復(fù)機(jī)制，對(duì)基因組進(jìn)行定點(diǎn)改造。

ZFN 和TALEN 都可以對(duì)DNA 進(jìn)行各種遺傳修飾，它們的作用機(jī)制都是先對(duì)DNA 雙鏈分子進(jìn)行切割，形成DNA雙鏈斷裂切口，然后激活細(xì)胞內(nèi)的非同源末端連接修復(fù)機(jī)制，或者同源重組修復(fù)機(jī)制，再利用細(xì)胞自身的修復(fù)機(jī)制對(duì)DNA進(jìn)行遺傳學(xué)修飾。

在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)入位點(diǎn)特異性的核酸酶和攜帶有位點(diǎn)特異性同源序列的外源質(zhì)粒，能夠以極高的效率在細(xì)胞基因組特定的位點(diǎn)轉(zhuǎn)入一個(gè)或者多個(gè)轉(zhuǎn)基因序列（圖6A）。通過(guò)這種方法，可以轉(zhuǎn)入一段不超過(guò)50bp的線性外源同源序列或者單鏈的DNA寡核苷酸鏈，在細(xì)胞基因組內(nèi)的特定位點(diǎn)引入替換突變、缺失突變或者插入突變。位點(diǎn)特異性的核酸酶除了能夠提高同源重組的效率之外，還能夠以很快的速度構(gòu)建null表型（null phenotype）的細(xì)胞系和模式生物。這些核酸酶產(chǎn)生DSB之后如果啟動(dòng)了NHEJ（非同源末端連接修復(fù)機(jī)制）修復(fù)機(jī)制，那么就會(huì)在DSB位點(diǎn)處引入小段的缺失突變或者是插入突變，使基因發(fā)生移碼，從而起到敲除基因功能的作用（圖6B）。這些位點(diǎn)特異性的核酸酶還能夠引入大段的染色體缺失突變，使染色體發(fā)生大段的倒位（inversion）和轉(zhuǎn)位（translocation）。

圖6 A/B使用位點(diǎn)特異性核酸酶進(jìn)行基因組編輯操作。

核酸酶切割DNA 形成DSB 之后細(xì)胞可能會(huì)借助同源重組修復(fù)途徑，或者是NHEJ（非同源末端連接修復(fù)機(jī)制）修復(fù)途徑對(duì)DSB進(jìn)行修復(fù)。（A）在缺乏外源質(zhì)粒DNA模版的情況下，細(xì)胞會(huì)通過(guò)NHEJ機(jī)制進(jìn)行修復(fù)，在基因組中形成小型的插入或者缺失突變。在存在雙鏈寡聚核苷酸分子，或者在細(xì)胞內(nèi)存在線性的質(zhì)粒片段時(shí)，可以通過(guò)NHEJ機(jī)制在基因組中插入大段的DNA序列，最長(zhǎng)可以插入14kb的序列。同時(shí)形成兩種DSB之后會(huì)形成缺失、倒位或者倒位的序列轉(zhuǎn)位等突變。（B）在存在同源序列的外源模版的情況下，細(xì)胞會(huì)通過(guò)同源重組修復(fù)機(jī)制修復(fù)DSB，在基因組內(nèi)插入1個(gè)或者多個(gè)轉(zhuǎn)基因，或者對(duì)基因組中的錯(cuò)誤基因進(jìn)行修復(fù)［10］。

4 展望

巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，彌補(bǔ)了大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)不易表達(dá)復(fù)雜蛋白的限制以及植物、動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)周期長(zhǎng)、操作繁瑣、成本高的缺點(diǎn)，完善了釀酒酵母分泌效率低、表達(dá)菌株不夠穩(wěn)定、表達(dá)質(zhì)粒易丟失等缺陷，是一種優(yōu)秀外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)。但其自身還存在著表達(dá)人源性蛋白時(shí)過(guò)糖基化等缺點(diǎn)，仍有待進(jìn)一步優(yōu)化。

基因敲除是酵母研究中最有效和最重要的技術(shù)之一。對(duì)于釀酒酵母的基因敲除技術(shù)發(fā)展得比較成熟，釀酒酵母的基因敲除只需幾十至幾百個(gè)堿基的同源臂序列，且敲除效率較高；而對(duì)于畢赤酵母而言，基因敲除需要幾百乃至上千個(gè)堿基的同源臂序列，且敲除效率遠(yuǎn)低于釀酒酵母，尤其是對(duì)于一些影響菌體生長(zhǎng)、代謝的基因，其敲除效率很低，往往難以獲得正確敲除的菌株。因而，尋找高效的巴斯德畢赤酵母基因敲除方法對(duì)進(jìn)一步研究和優(yōu)化巴斯德蛋白表達(dá)系統(tǒng)有著重要的意義。

有標(biāo)記的插入替換基因缺失方法操作簡(jiǎn)單，比較容易篩選得到基因缺失菌。目前在畢赤酵母中可用的篩選標(biāo)記有限，因而有標(biāo)記的插入替換方法在進(jìn)行多基因缺失時(shí)具有一定的局限性。無(wú)標(biāo)記的Pop-In/Pop-Out方法相對(duì)比較復(fù)雜，篩選工作量大。但是在基因缺失后，宿主菌的染色體上不會(huì)留下任何外源片段，特別適合多基因缺失或是改造基因工程菌。

URA3、T-urf13、mazF 基因作為反向篩選標(biāo)記的Pop-In/Pop-Out 方法敲除基因，是基于敲除質(zhì)粒的構(gòu)建去引入同源臂，然后在生長(zhǎng)壓力條件下，利用兩拷貝同源臂之間的相同序列實(shí)現(xiàn)二次重組，再利用標(biāo)記基因篩選出基因敲除后的重組菌。為了提高篩選效率，常根據(jù)被敲除的宿主菌的性質(zhì)同時(shí)引入一個(gè)正向篩選標(biāo)記，進(jìn)行正反向篩選。但在標(biāo)記刪除達(dá)到之前時(shí)常需要多于10天的時(shí)間，比較耗時(shí)。

同樣是通過(guò)兩步同源重組實(shí)現(xiàn)基因敲除，Cre-loxP重組系統(tǒng)不依賴于敲除質(zhì)粒的構(gòu)建，而是通過(guò)構(gòu)建刪除表達(dá)盒。Cre-loxP 重組系統(tǒng)只需引入一個(gè)正向篩選標(biāo)記，同時(shí)它的二次重組是依賴于Cre 重組酶催化的loxP71 與loxP66之間的重組，只需啟動(dòng)Cre的轉(zhuǎn)錄翻譯即可，較需要生長(zhǎng)壓力條件來(lái)實(shí)現(xiàn)菌體自身二次重組的反向篩選標(biāo)記的方法要簡(jiǎn)單、快捷。因而，Cre-loxP重組系統(tǒng)在巴斯德畢赤酵母的基因敲除方法中具有巨大的應(yīng)用前景，為進(jìn)一步優(yōu)化多基因缺失與改造畢赤酵母基因工程菌的方法提供了思路。

序列特異性的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與非特異性的DNA切割結(jié)構(gòu)域組合而成的人工核酸酶是基因組編輯技術(shù)的重要組成部分，ZFN和TALEN等嵌合式的核酸酶能夠以極高的效率、極高的精確度對(duì)基因組進(jìn)行人工修飾。

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