辛玉宏 ，賴建生，趙國平，肖寧新，鄭東升，陳 虎，張 艷，張 慧，劉春曉

（南方醫(yī)科大學(xué)附屬江門醫(yī)院：1.泌尿外科；2.病理科；3.圖書館，廣東江門 529000；4.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院泌尿外科，廣東廣州 510280）

前列腺增生癥（benign prostatic hyperplasia，BPH）是老年男性常見的疾病之一，目前血清前列腺特異抗原（prostate specific antigen，PSA）是最常用的前列腺腫瘤指標(biāo)，對(duì)術(shù)前預(yù)測前列腺性質(zhì)起到重要作用，但近年P(guān)SA 的此作用逐漸被質(zhì)疑，學(xué)界存在不同的意見。在前列腺增生的過程中，已有多位學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長因子C（vascular endothelial growth factor，VEGF－C）可能通過誘導(dǎo)前列腺血管及淋巴管內(nèi)皮的增生［1］，促進(jìn)前列腺增生，而VEGFC與血清PSA 之間是否有相關(guān)性，本研究試圖對(duì)此進(jìn)行探討。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集本院2011年6月至2013年6月術(shù)后確診為BPH 的患者150 例，術(shù)前測定血清PSA 值，采血前均未服用5α還原酶抑制劑，未行前列腺指檢，無急性泌尿系感染，未留置尿管，所有患者均使用相同的等離子電切系統(tǒng)（Olympus）行經(jīng)尿道前列腺雙極汽化電切術(shù)，術(shù)中保持有效功率的低值，避免長時(shí)間電凝，尤其是切割前列腺尖部組織，避免組織過度汽化損傷括約肌，術(shù)后獲取前列腺組織。

實(shí)驗(yàn)對(duì)象根據(jù)術(shù)前血清總PSA（total PSA，tPSA）及PSA 比值（f／t）分為5 組：Ⅰ組tPSA＜2.5 ng／mL，Ⅱ組2.5≤tPSA≤4ng／mL，Ⅲ組4＜tPSA≤10ng／mL 且f／t＞0.16，Ⅳ組4＜tPSA≤10ng／mL且f／t≤0.16，Ⅴ組10＜tPSA＜20ng／mL。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 主要試劑兔抗人VEGF－C 多克隆抗體、DAB粉劑，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，ElivisionTMPlus檢測試劑盒購自福州邁新公司，其他常用試劑為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 采用ElivisionTMPlus 二步法制作病理玻片。前列腺組織甲醛固定，石蠟包埋，3.5μm連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟入水，PBS液（pH7.4）浸泡，放入含有抗原修復(fù)液的高壓鍋內(nèi)進(jìn)行熱修復(fù)，自然冷卻至室溫，放入3%（體積分?jǐn)?shù)）過氧化氫溶液浸泡，消除內(nèi)源性過氧化物酶，滴加一抗工作液，室溫下孵育60 min，PBS 液浸泡，滴加聚合物增強(qiáng)劑工作液（試劑A），室溫孵育20min，滴加酶標(biāo)抗鼠／兔聚合物工作液（試劑B），室溫孵育30 min，PBS 液浸泡，滴加DAB顯色液，顯微鏡下觀察染色程度，蒸餾水沖洗，蘇木素復(fù)染，酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照，人淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌標(biāo)本作為VEGF－C陽性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定 制作好的病理玻片由病理科2位醫(yī)生閱片，判定標(biāo)準(zhǔn)以細(xì)胞核不染色、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性染色。根據(jù)200倍光鏡下隨機(jī)觀察5個(gè)含腺體的視野，觀察前列腺腺體上皮細(xì)胞，根據(jù)陽性染色細(xì)胞的比例進(jìn)行評(píng)分：未見染色為0分，染色細(xì)胞數(shù)1%～5%為1分，6%～10%為2分，11%～15%為3分，16%～20%為4分，20%以上為5分。根據(jù)2位醫(yī)生結(jié)果計(jì)算平均得分，0～1分為陰性，2～3分為弱陽性，4分以上為陽性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)、單向方差分析和非參數(shù)檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 VEGF－C 在前列 腺組織 中的表達(dá)在150 例BPH 組織中VEGF－C 表達(dá)陰 性率為17.3%（0 分4.0%，1 分13.3%），弱陽性率為55.3%（2 分25.3%，3 分30.0%）、陽性率 為27.4%（4 分20.7%，5分6.7%，表1）。VEGF－C 主要著色部位為腺體上皮細(xì)胞胞質(zhì)，呈棕黃至棕褐色染色，在基底細(xì)胞表達(dá)較弱（圖1）。

表1 VEGF－C在前列腺組織中的表達(dá) （例）

圖1 前列腺增生組織中VEGF－C的表達(dá)（SP，×200）

2.2 VEGF－C 的表達(dá)水 平與年齡、前列腺體積、tPSA、PSA密度的關(guān)系 首先采用Levene檢驗(yàn)各因素方差齊性，年齡及前列腺體積因素方差具有齊性，tPSA 及PSA 密度方差不齊。方差齊性采用單向方差分析，不同VEGF－C 表達(dá)水平組中年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝2.166，P＞0.05），采用Spearman 相關(guān)分析，表明VEGF－C 的表達(dá)水平與年齡無關(guān)（r＝0.121，P＞0.05）。同法比 較前列 腺體積，不 同VEGF－C表達(dá)水平組中前列腺體積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r＝0.365，P＜0.01），表明VEGF－C 的表達(dá)水平與前列腺體積呈弱正相關(guān)關(guān)系，VEGF－C的表達(dá)強(qiáng)度越高，前列腺體積越大。方差不齊采用近似方差分析（Welch法及Brown－Forsythe法），不同VEGF－C 表達(dá)水平組中血清總PSA 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r＝0.693，P＜0.01），表明VEGF－C 的表達(dá)水平與血清總PSA 呈較強(qiáng)的正相關(guān)關(guān)系，VEGF－C 的表達(dá)強(qiáng)度越高，血清總PSA 越高。同法比較PSA 密度，不同VEGF－C表達(dá)水平組中PSA 密度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r＝0.563，P＜0.01），表明VEGF－C 的表達(dá)水平與PSA 密度呈較強(qiáng)的正相關(guān)關(guān)系，VEGF－C 的表達(dá)強(qiáng)度越高，PSA 密度越高（表2）。

表2 VEGF－C表達(dá)水平與年齡、前列腺體積、總PSA、PSA密度的關(guān)系 （）

表2 VEGF－C表達(dá)水平與年齡、前列腺體積、總PSA、PSA密度的關(guān)系 （）

2.3 PSA 分組與年齡、前列腺體積、VEGF－C的關(guān)系不同PSA 組中，年齡無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，除Ⅲ組和Ⅳ組外，余各組前列腺體積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表3）。不同PSA 組中，VEGF－C 的表達(dá)水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），其中Ⅰ＋Ⅱ組、Ⅲ＋Ⅳ組及Ⅴ組各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Ⅲ組和Ⅳ組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在灰區(qū)內(nèi)，Ⅳ組VEGF－C 的表達(dá)水平比Ⅲ組強(qiáng)。不同PSA 組與VEGF－C 的表達(dá)水平呈較強(qiáng)正相關(guān)關(guān)系。在正常水平PSA 組中，Ⅱ組VEGF－C 的表達(dá)水平比Ⅰ組強(qiáng)（表1、表3）。

表3 各PSA組年齡、前列腺體積、VEGF－C的關(guān)系（）

表3 各PSA組年齡、前列腺體積、VEGF－C的關(guān)系（）

2.4 年齡、前列腺體積與tPSA、PSA 密度、VEGF－C的關(guān)系 患者年齡與前列腺體積正相關(guān)，而與tPSA、PSA 密度、VEGF－C 不相關(guān)，而前列腺體積則與tPSA、VEGF－C正相關(guān)，與PSA 密度無關(guān)（表4、5）。

表4 年齡與前列腺體積、tPSA、PSA密度、VEGF－C的關(guān)系

表5 前列腺體積與年齡、tPSA、PSA密度、VEGF－C的關(guān)系

3 討論

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，VEGF 在正常前列腺組織中低表達(dá)，在BPH 組織有較高表達(dá)，在前列腺癌組織中有高表達(dá)，3種組織中VEGF 的表達(dá)有顯著性差異，推測VEGF在前列腺的病理生理方面發(fā)揮著重要作用，它的表達(dá)強(qiáng)度可能預(yù)示著BPH 的發(fā)生發(fā)展以及癌變的趨勢(shì)。因VEGF－C可選擇性誘導(dǎo)淋巴管的增生，故也稱淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子。它有兩個(gè)受體，分別表達(dá)于血管和淋巴內(nèi)皮細(xì)胞，既能誘導(dǎo)血管生成又能誘導(dǎo)淋巴管生成［1］。通過研究VEGF－C 與微血管密度及淋巴管密度在BPH 及前列腺癌中的表達(dá)，推測出VEGF－C 可通過促進(jìn)前列腺組織血管及淋巴管的生成，從而促進(jìn)前列腺細(xì)胞增生及促使細(xì)胞癌變。細(xì)胞的正常及過度增生均離不開血管的供養(yǎng)，有研究表明BPH 組織中結(jié)節(jié)區(qū)微血管密度顯著高于非結(jié)節(jié)區(qū)，兩者均顯著高于正常前列腺組織，BPH 中VEGF－C 表達(dá)強(qiáng)度與微血管密度值之間呈顯著正相關(guān)。另一方面，前列腺癌最常見轉(zhuǎn)移部位為淋巴結(jié)及骨轉(zhuǎn)移，淋巴管的增生對(duì)于細(xì)胞的供養(yǎng)雖不及血管重要，但作為重要的輸出通道，對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展尤其轉(zhuǎn)移起了至關(guān)重要的作用。TROJAN等［2］發(fā)現(xiàn)BPH 組織內(nèi)的淋巴管密度高于前列腺癌和正常組織，但多數(shù)學(xué)者研究表明，在同一組織內(nèi)，癌組織淋巴管密度要比BPH 組織及正常組織高，VEGF－C通過誘導(dǎo)淋巴管密度增加，使腫瘤細(xì)胞有更多機(jī)會(huì)接觸淋巴管，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移［3］。本組數(shù)據(jù)也顯示，VEGF－C的表達(dá)越強(qiáng)，前列腺體積越大。而不少研究指出，在前列腺癌中，VEGF－C 的表達(dá)強(qiáng)度比BPH 要高，兩者有顯著性差異，而且VEGF－C 的表達(dá)強(qiáng)度與前列腺癌病理分級(jí)呈正相關(guān)關(guān)系。

VEGF廣泛分布于前列腺癌和前列腺增生組織的腺上皮細(xì)胞、基底細(xì)胞和血管壁及其周圍組織細(xì)胞。在BPH 組織中主要表達(dá)在腺上皮細(xì)胞，基底細(xì)胞較少，而腫瘤組織間質(zhì)、腺上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞均有表達(dá)，以腺上皮細(xì)胞表達(dá)最強(qiáng)。對(duì)于VEGF 的調(diào)節(jié)，RICHARD等［4］發(fā) 現(xiàn)VEGF 的表達(dá) 受雄激 素調(diào)節(jié)。PAREEK等［5］通過設(shè)計(jì)非那雄胺組和安慰劑組的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)服用非那雄胺組前列腺組織內(nèi)VEGF的表達(dá)下調(diào)。KWAK等［6］研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌去勢(shì)治療后的前列腺組織中VEGF 表達(dá)減少。眾所周知，前列腺癌與雄激素有關(guān)，這些研究結(jié)果表明，VEGF的表達(dá)受到雄激素的調(diào)節(jié)，雄激素可以促進(jìn)VEGF的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致BPH 的發(fā)展以及前列腺癌的發(fā)生。

隨著診斷水平的提高，前列腺癌發(fā)病率有超越膀胱腫瘤的趨勢(shì)。PSA 作為目前最常用的前列腺腫瘤指標(biāo)，除了在前列腺癌早期診斷及術(shù)后隨訪外，有文獻(xiàn)報(bào)道PSA 作為一種蛋白酶可以活化胰島素樣生長因子和轉(zhuǎn)化生長因子，促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的生長與轉(zhuǎn)移［7］，而VEGF－C 也被證實(shí)與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，兩者之間可能存在某種聯(lián)系。在傳統(tǒng)的觀點(diǎn)里，PSA＜4ng／mL 時(shí)，除非指檢或影像學(xué)檢查有異常，基本可認(rèn)定為良性，但近期國內(nèi)外較多文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，在tPSA≤10ng／mL 甚至＜4ng／mL 的情況下，仍有相當(dāng)比例的患者證實(shí)為前列腺癌，美國國家癌癥網(wǎng)甚至認(rèn)為當(dāng)tPSA≥2.5ng／mL 時(shí)即應(yīng)進(jìn)行活檢［8］。國外報(bào)道的tPSA＜4ng／mL的前列腺癌占前列腺癌患者的比例，最高達(dá)25%，平均約為15%，而在tPSA＜2.5ng／mL 的前列腺癌當(dāng)中，有36.4%術(shù)后病理證實(shí)為高級(jí)別的前列腺癌（Gleason 7分或更高）或前列腺癌包膜外侵犯和陽性切緣［9］。因此是否應(yīng)該對(duì)tPSA＜4ng／mL 的患者進(jìn)一步細(xì)分？國內(nèi)張榮華等［10］建議當(dāng)tPSA＜4ng／mL 時(shí)，如果f／tPSA＜0.20，或者PSAD＞0.1，則應(yīng)注意前列腺癌可能。而國外有學(xué)者研究時(shí)將其分為＜2.5ng／mL 組及2.5≤tPSA≤4ng／mL組，但兩者惡性率分別為13.3%及13.6%，無顯著差異［11］。SCOTT等［12］通過回顧36 316例前列腺癌患者的tPSA，得出將tPSA 臨界值設(shè)定為2.5ng／mL比4ng／mL更為準(zhǔn)確。但上述研究對(duì)象均為前列腺癌，暫未見到有研究探討對(duì)BPH 的分組。

BPH 手術(shù)治療僅切除增生的部分或全部腺體，而被切除的腺體位于移行帶，并非前列腺癌多發(fā)生的外周帶，而術(shù)后病理是隨機(jī)選擇小部分組織活檢，以上因素導(dǎo)致病理假陰性的可能。前列腺組織中VEGF－C的表達(dá)水平可作為前列腺術(shù)后復(fù)發(fā)及前列腺增生惡變的預(yù)測因子，尤其是對(duì)于術(shù)前PSA 異常升高而術(shù)后病理陰性的病例。本研究參照文獻(xiàn)對(duì)于tPSA 分組的新觀點(diǎn)進(jìn)行分組，研究結(jié)果支持目前傳統(tǒng)的tPSA 分組方法，值得注意的是如果按照傳統(tǒng)的VEGF－C表達(dá)強(qiáng)度評(píng)分，Ⅰ、Ⅱ組間VEGF－C 的表達(dá)并無顯著性差異，但將評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)細(xì)化后，兩組間出現(xiàn)了顯著性差異，這與目前國外部分研究的觀點(diǎn)相符合。究竟兩組之間的差異是確實(shí)存在，還是只是一種巧合、Ⅰ、Ⅱ組間VEGF－C的表達(dá)差異有無實(shí)質(zhì)的意義等問題仍需進(jìn)一步研究。

［1］JEANNY B，WILLIAM L.VEGF inhibitors and prostate cancer therapy［J］.Curr Mol Pharmacol，2009，2（2）：161－168.

［2］TROJAN L，RENSCH F，VOSS M，et al.The role of the lymphatic system and its specific growth factor，vascular endothelial growth factor C，for lymphogenic metastasis in prostate cancer［J］.BJU Int，2006，98（4）：903－906.

［3］TOHRU H，NAOHIDE I，JEROEN H，et al.Imaging steps of lymphatic metastasis reveals that vascular endothelial growth factor－c increases metastasis by increasing delivery of cancer cells to lymphnodes：therapeutic implications［J］.Cancer Res，2006，66（24）：8065－8075.

［4］RICHARD C，KIM G，KOIKAWA Y，et al.Androgens modulate the balance between VEGF and angiopoiet in expression in prostate epithehal and smooth musclecells［J］.Prostate，2002，50（2）：83－91.

［5］PAREEK G，SHEVCHUK M，ARMENAKAS NA，et al.The effect of finasteride on the expression of vascular endothelial growth factor and microvessel density：apossible mechanism for decreased prostatic bleeding in treated patients［J］.J Urol，2003，169（1）：20－23.

［6］KWAK C，JIN RJ，LEE C，et al.Thrombospondin－l，vascular endothelial growth factor expression and their relationship with p53 status in prostate cancer and benign prostatic hyperplasia［J］.BJU Int，2002，89（3）：303－309.

［7］蔣琪，韓邦旻，夏術(shù)階，等.PSA 對(duì)前列腺細(xì)胞的生長調(diào)控［J］.國際泌尿系統(tǒng)雜志，2008，28（3）：348－350.

［8］MARK HK，ROBERT RB，MICHAEL B，et al.Prostate cancer early detection clinical practice guidelines in oncology［J］.JNCCN，2010，8（2）：240－262.

［9］孫其鵬，高新.PSA＜2.5ng／mL的前列腺癌的特性［J／OL］.中華腔鏡泌尿外科雜志（電子版），2009，3（3）：274.

［10］張榮華，湯元杰，邱鎮(zhèn).前列腺特異抗原小于4ug／L前列腺癌的診斷［J］.中國人民武裝警察部隊(duì)醫(yī)學(xué)雜志，2006，17（2）：125－127.

［11］KIM YJ，KIM SO，RYU WH，et al.Prostate cancer can be detected even in patients with decreased PSA Less than 2.5ng／ml after treatment of chronic prostatitis［J］.KJ Urol，2011，52（7）：457－460.

［12］SCOTT M，CHRISTINA B，F(xiàn)RANKLIN C，et al.Evidence suggesting PSA cutpoint of 2.5ng／mL for prompting prostate biopsy：review of 36316biopsies［J］.Urology，2005，65（3）：549－553.