陳志華，王勤章，丁國(guó)富，錢(qián) 彪，李 強(qiáng)，倪 釗

（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，新疆石河子 832000）

腎透明細(xì)胞癌是腎臟最常見(jiàn)的惡性腫瘤，約10%～25%的患者可能會(huì)發(fā)生腎門(mén)和局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，淋巴結(jié)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移表明患者的預(yù)后不良［1］。多年來(lái)由于缺乏淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的特異標(biāo)記物，對(duì)于淋巴管的研究相對(duì)較少，也未引起足夠的重視。近年來(lái)，由于D2－40能特異地標(biāo)記淋巴管而被學(xué)者作為一免疫組織化學(xué)物應(yīng)用于標(biāo)記腫瘤淋巴管新生［2］。目前腎透明細(xì)胞癌淋巴管新生對(duì)患者預(yù)后的影響還不清楚，本研究旨在利用D2－40來(lái)標(biāo)記淋巴管，探討腎透明細(xì)胞癌淋巴管新生與臨床病理因素的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 研究對(duì)象是在石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科收集的2005～2012年被診斷為腎透明細(xì)胞癌的60例患者的石蠟塊。納入標(biāo)準(zhǔn)：調(diào)閱蠟塊的HE切片包含癌組織和正常腎組織。26 例女性，34例男性，患者年齡35～71 歲，平均（58.21±11.34）歲。所有患者均行根治性腎切除術(shù)或腎部分切除術(shù)，其中15例患者因懷疑淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，術(shù)中行淋巴結(jié)清掃，其余45例患者沒(méi)有行淋巴結(jié)清掃。臨床病理因素包括遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、T 分期及Furman細(xì)胞核分級(jí)從患者病例資料和術(shù)后病理檢查結(jié)果獲得。

1.2 染色方法 采用SP 法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，單克隆抗體D2－40（ZM－0465）和二抗試劑盒均購(gòu)至北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。將石蠟塊4μm連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，乙醇水化。用3% 的過(guò)氧化氫浸泡10min來(lái)阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，然后將玻片放入0.01mol／L、pH6.0的檸檬酸緩沖液中，置入高壓鍋中加熱至噴氣后開(kāi)始計(jì)時(shí)，8min后停止加熱以充分暴露抗原。滴加鼠抗人D2－40抗體，4℃孵育過(guò)夜，加入第二抗體，37℃恒溫箱反應(yīng)30 min。隨后用二胺基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽在顯微鏡下觀察顯色，顯色時(shí)間依觀察結(jié)果靈活掌握調(diào)控。再經(jīng)蘇木精對(duì)比染色，脫水、透明、封片。以磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照，用已知陽(yáng)性結(jié)果作陽(yáng)性對(duì)照。處理完成后用光學(xué)顯微鏡來(lái)觀察。

1.3 結(jié)果判定 所有的標(biāo)本均由兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師進(jìn)行雙盲法閱片。免疫組化切片中見(jiàn)D2－40標(biāo)記的條索狀、管腔樣結(jié)構(gòu)的細(xì)胞胞質(zhì)或胞膜內(nèi)出現(xiàn)棕黃色標(biāo)記物為陽(yáng)性，一個(gè)管腔切面或一條條索狀物計(jì)數(shù)為一條新生淋巴管。腫瘤組織外500μm 區(qū)域被認(rèn)為是癌周組織區(qū)域。首先在10×10倍鏡視野確定每張組織切片內(nèi)陽(yáng)性染色脈管最豐富區(qū)，再在10×20倍視野下隨機(jī)取3個(gè)視野計(jì)數(shù)淋巴管數(shù)目，統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野中的淋巴管數(shù)目，然后取3個(gè)視野平均值作為癌周淋巴管密度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0版軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。淋巴管新生與臨床病理因素的相關(guān)性，用χ2檢驗(yàn)或Fisher's確切概率法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

60例研究對(duì)象均為腎透明細(xì)胞癌。按Fuhrman細(xì)胞核分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)，其中Ⅰ級(jí)4 例，Ⅱ級(jí)38例，Ⅲ級(jí)17例，Ⅳ級(jí)1例。按2011年的腎腫瘤TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，36例 為pT1，7 例 為pT2，15 例為pT3，2例為pT4。6例發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，行淋巴結(jié)清掃的患者有5例出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

2.1 D2－40在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)情況 通過(guò)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)癌旁正常腎組織內(nèi)在血管周?chē)猩倭康牧馨凸?；癌周區(qū)淋巴管豐富，擴(kuò)張與閉鎖的淋巴管共存，以擴(kuò)張的淋巴管為主；在癌內(nèi)區(qū)，淋巴管的數(shù)量明顯減少甚至缺如，故僅觀察癌內(nèi)是否有淋巴管出現(xiàn)（圖1）。

圖1 D2－40在腎透明細(xì)胞癌組織（DAB，×200）

2.2 D2－40在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系 所有研究對(duì)象均觀察到豐富的癌周淋巴管（peritumoral lymphatic vessels，PLVs），13例觀察到有癌內(nèi)淋巴管（intratumoral lymphatic vessels，ILVs）出現(xiàn)。平均的癌周淋巴管密度（peritumoral lymphatic vessels density，PLVD）是16.89，29例患者的PLVD≥16.89，31例患者的PLVD＜16.89，兩組在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Fuhrman細(xì)胞核分級(jí)及腫瘤T 分期間的比較結(jié)果均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表1）。

按癌內(nèi)是否有淋巴管出現(xiàn)分為陽(yáng)性表達(dá)組（ILV－positive）和陰性表達(dá)組（ILV－negative），兩組間在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，F(xiàn)uhrman細(xì)胞核分級(jí)的比較結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），對(duì)于腫瘤T 分期則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表2）。

表1 PLVD與臨床病理因素間的相關(guān)性 （例）

表2 ILVs的出現(xiàn)與臨床病理因素間的相關(guān)性

3 討論

腎透明細(xì)胞癌是腎臟最常見(jiàn)的癌癥，有很多的臨床病理因素對(duì)患者的預(yù)后有影響，包括遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期、Fuhrman細(xì)胞核分級(jí)及血管侵犯等。目前已有大量的學(xué)者在進(jìn)行腎腫瘤血管方面的研究，對(duì)于淋巴管方面的研究相對(duì)較少，這一現(xiàn)狀直到淋巴內(nèi)皮細(xì)胞D2－40的出現(xiàn)才得到改善。D2－40分子是MARKS等［3］于1999年在研究生殖細(xì)胞腫瘤和胚胎睪丸的精母細(xì)胞表面時(shí)新發(fā)現(xiàn)的一種唾液酸黏蛋白。SAAD等［4］的研究發(fā)現(xiàn)D2－40能特異性地標(biāo)記淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，而不標(biāo)記毛細(xì)血管，更不標(biāo)記血管內(nèi)皮，被視為最佳的淋巴管標(biāo)記物，被越來(lái)越多應(yīng)用于區(qū)別血管和淋巴管。一些研究已經(jīng)在利用D2－40采用免疫組織化學(xué)的方法來(lái)評(píng)價(jià)淋巴管新生與臨床病理因素之間的關(guān)系。

在我們的研究中，60例腎透明細(xì)胞癌患者的標(biāo)本均發(fā)現(xiàn)有豐富的PLV，平均PLVD 為16.89，我們經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)PLVD 與臨床病理因素均無(wú)相關(guān)性，表明癌周淋巴管新生對(duì)患者的預(yù)后可能無(wú)影響。這一結(jié)果與IWATA T等［5］的研究相似，他們發(fā)現(xiàn)在腎細(xì)胞癌中，癌周淋巴管數(shù)與臨床病理因素?zé)o明顯的相關(guān)性，認(rèn)為癌周淋巴管對(duì)于腫瘤的進(jìn)展起次要的作用。ISHIKAWA等［6］的研究 通過(guò)應(yīng) 用D2－40 進(jìn) 行免疫組化染色能清楚顯示正常和病理狀態(tài)下腎組織的淋巴管分布，他們的研究結(jié)果也表明腎細(xì)胞癌PLV 的數(shù)量較正常的腎皮質(zhì)明顯的增加，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)PLVD 與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性，BALDEWIJNS等［7］的研究則表明癌周淋巴管新生與腫瘤TNM 分期及Fuhrman細(xì)胞核分級(jí)無(wú)關(guān)系，認(rèn)為癌周與正常的腎組織淋巴管數(shù)量無(wú)差異。而丁貴坡等［8］發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中PLVD 與腫瘤的大小、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)相關(guān)。ZENG等［9］發(fā)現(xiàn)在前列腺癌中，癌周淋巴管密度和癌周淋巴管侵犯與腫瘤淋巴管轉(zhuǎn)移有顯著的相關(guān)性。間接表明癌周淋巴管新生對(duì)患者的預(yù)后有不良影響，與我們的結(jié)果相悖。本研究?jī)H有13例患者的標(biāo)本發(fā)現(xiàn)ILV，淋巴管數(shù)較少，大部分呈長(zhǎng)條形或塌陷狀態(tài)，考慮為癌組織間高壓所致。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴管轉(zhuǎn)移及Fuhrman細(xì)胞核分級(jí)均與ILV 的出現(xiàn)有顯著的相關(guān)性。ILYAS等［10］的研究結(jié)果與我們相似，他們同樣沒(méi)有發(fā)現(xiàn)PLVD與臨床病理因素有相關(guān)性，ILVs與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和淋巴管轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性。PAWEL DE BIńSKI等［11］也發(fā)現(xiàn)癌內(nèi)淋巴管的出現(xiàn)與臨床病理因素有顯著相關(guān)性。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和淋巴管轉(zhuǎn)移及Fuhrman細(xì)胞核分級(jí)已被證實(shí)與腫瘤患者預(yù)后密切相關(guān)，說(shuō)明癌內(nèi)淋巴管新生在腫瘤的進(jìn)展中起重要的作用，故我們有理由相信癌內(nèi)淋巴管新生對(duì)患者的預(yù)后可能有不良影響。至于癌內(nèi)淋巴管新生如何對(duì)患者的預(yù)后造成影響，其原因尚不明確。相關(guān)研究提示多種惡性腫瘤組織中存在新生淋巴管，但癌細(xì)胞是通過(guò)已有的淋巴管還是新生的淋巴管轉(zhuǎn)移存在很大爭(zhēng)議［12］。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為腫瘤的淋巴道轉(zhuǎn)移是一個(gè)被動(dòng)過(guò)程，腫瘤細(xì)胞通過(guò)已有的局部淋巴管轉(zhuǎn)移到區(qū)域淋巴結(jié)，其中淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞只是起到被動(dòng)作用。在本研究中，僅少數(shù)患者有ILV 出現(xiàn)且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P＝0.017），故我們考慮癌內(nèi)新生的淋巴管可能促進(jìn)了淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移。具體的機(jī)制還需要大量相關(guān)研究來(lái)探討。

綜上所述，我們認(rèn)為癌內(nèi)淋巴管新生可能對(duì)腎透明細(xì)胞癌患者的預(yù)后有不良影響，可以作為判斷患者術(shù)后預(yù)后不良的因素，對(duì)術(shù)后患者預(yù)后的預(yù)測(cè)及輔助治療擴(kuò)展思路，提供臨床應(yīng)用價(jià)值。但還需要大樣本研究來(lái)進(jìn)一步證實(shí)，因?yàn)檫@一類(lèi)的相關(guān)研究較少，且他們的研究結(jié)果往往相矛盾。下一步我們將對(duì)患者預(yù)后資料進(jìn)行收集和分析來(lái)進(jìn)一步論證腎透明細(xì)胞癌淋巴管新生對(duì)患者預(yù)后的影響。

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