秦小舒，曹福亮，逯 巖，郁萬(wàn)文，林芳芝

(南京林業(yè)大學(xué) 森林資源與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210037)

銀杏(Ginkgo biloba L.)是我國(guó)主要經(jīng)濟(jì)樹(shù)種之一，其樹(shù)、葉、果、皮、花等廣泛用于醫(yī)療保健與觀賞［1］。銀杏傳統(tǒng)的育種方式周期較長(zhǎng)，難以滿足優(yōu)良種質(zhì)資源的需求，組織培養(yǎng)是實(shí)現(xiàn)優(yōu)良品種快速繁殖的重要途徑。其中合子胚因其分化程度低常被用做外植體，銀杏心形胚、近成熟胚能誘導(dǎo)出少量不定芽，但芽未能生根［2-3］;未成熟胚能誘導(dǎo)出少量體胚，但各階段畸形胚比率高，未能成苗［4-5］或少量成苗［6］。提高愈傷組織不定芽或體胚的分化率將加快銀杏組培的工廠化育苗進(jìn)程。研究表明，AgNO3能促進(jìn)外植體不定芽的分化及體胚的發(fā)生，同時(shí)顯著降低褐化，提高生長(zhǎng)量，在組織培養(yǎng)中應(yīng)用十分廣泛［7-9］。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于AgNO3在銀杏組培中的應(yīng)用鮮有報(bào)道。本研究將以不同發(fā)育時(shí)期銀杏胚為外植體，初步探討AgNO3對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及分化的影響，以期為建立銀杏高效再生體系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試材為江蘇泰州大佛指，于2013 年9 月采集并4 ℃低溫保存。分別取3 個(gè)階段銀杏胚進(jìn)行研究:(1)10 月16 日胚，早期心形胚至魚(yú)雷形胚，胚長(zhǎng)1～2.7 mm(圖1:A，B)，接種時(shí)取全胚;(2)11 月16日胚，子葉伸長(zhǎng)且閉合，稍部尖形，胚長(zhǎng)2.5～4 mm(圖1:C)，接種時(shí)取全胚;(3)1 月3 日胚，子葉外張，胚芽發(fā)育基本成熟，胚長(zhǎng)＞3.5 mm(圖1:D)，接種時(shí)取子葉。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基與激素的篩選 采用雙因素隨機(jī)試驗(yàn)。培養(yǎng)基為MS，MT，DCR，外源激素為NAA(0.5，1.0 mg/L)與6-BA(1.0，2.0 mg/L)的組合，共12 個(gè)處理。10 月3 日接種，剝?nèi)ス琴|(zhì)中種皮后，于超凈臺(tái)上70%酒精1 min，10%次氯酸鈉15 min 進(jìn)行消毒。每個(gè)處理10 個(gè)胚，4 個(gè)重復(fù)。繼代周期20～25 d，下同。

1.2.2 AgNO3對(duì)不同時(shí)期銀杏胚愈傷組織誘導(dǎo)的影響 激素與培養(yǎng)基由上步篩選而出。外植體為3 個(gè)時(shí)期銀杏胚，AgNO3濃度為0，0.1，0.5，1.0，3.0，5.0 mg/L。AgNO3采取過(guò)濾方式滅菌。每瓶7個(gè)胚，共6 瓶。

1.2.3 隔代添加AgNO3對(duì)愈傷組織分化的影響 隔代添加AgNO3的處理方式為第一代添加，第二代不添加，第三代添加，依此類推。外植體為11 月16 日胚，AgNO3濃度為0，0.1，0.5，1.0，3.0 mg/L。每個(gè)處理5 瓶，每瓶7 個(gè)胚。

1.2.4 AgNO3避光處理對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響 兩種處理方式:處理1 為暗培養(yǎng)，AgNO3與外植體都遮光，外植體為10 月16 日胚，AgNO3濃度為0，0.1，0.3 mg/L;處理2 為添加活性炭，濃度500 mg/L，Ag-NO3處于避光狀態(tài)，外植體處于光照狀態(tài)，外植體為11 月16 日胚，，AgNO3濃度為0，0.1，0.5，1.0，3 mg/L。每個(gè)處理5 瓶，每瓶7 個(gè)胚。

1.3 統(tǒng)計(jì)及分析

數(shù)據(jù)采用Excel2003 與SPSS20.0 進(jìn)行分析。

2 結(jié)果及分析

2.1 培養(yǎng)基和激素的選擇

10 月3 日的胚多為心形胚魚(yú)雷形胚，胚較幼嫩，接種后容易失水死亡。接種后3 d 胚體膨大，10 d表皮脫分化形成愈傷組織，胚軸愈傷組織白色半透明，子葉愈傷組織淡黃或翠綠，質(zhì)地疏松，生長(zhǎng)旺盛。由表1 可知，各處理愈傷組織平均誘導(dǎo)率大于60%。雙因素方差分析顯示:植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑NAA(0.5～1 mg/L)，6-BA(1～2 mg/L)對(duì)胚愈傷組織誘導(dǎo)影響差異不顯著(P＞0.05)。而培養(yǎng)基DCR 與MS、MT 差異顯著，MS 與MT 差異不顯著(P＜0.05)。MS 與MT 屬于高鹽培養(yǎng)基，能很好的誘導(dǎo)愈傷組織，誘導(dǎo)率大于88%，DCR 屬于低鹽培養(yǎng)基，能較好的誘導(dǎo)愈傷組織，誘導(dǎo)率為60%～85%。考慮到愈傷組織的高誘導(dǎo)率會(huì)降低外植體對(duì)AgNO3的敏感程度，所以選擇DCR+NAA1.0 mg/L+6-BA1.0 mg/L為基本培養(yǎng)基進(jìn)行下一步的研究。

表1 不同培養(yǎng)基和激素對(duì)銀杏幼胚愈傷誘導(dǎo)的影響Tab.1 Effect of different mediums and hormones on callus induction of ginkgo embryos

2.2 AgNO3對(duì)不同時(shí)期銀杏胚愈傷組織誘導(dǎo)的影響

AgNO3處理下的愈傷組織較對(duì)照質(zhì)地堅(jiān)硬，色澤更綠，愈傷程度降低，且該趨勢(shì)隨AgNO3濃度的增加而加強(qiáng)。高濃度(3～5 mg/L)處理下，胚只輕微膨大，難以愈傷。3 個(gè)時(shí)期胚愈傷組織誘導(dǎo)率都隨AgNO3濃度的增加先升后降，但其對(duì)AgNO3的敏感程度不同:10 月胚的誘導(dǎo)率總體高于11 月胚而低于1 月胚的子葉。

由表2 可知，10 月16 日胚，在AgNO3濃度為1 mg/L 時(shí)，誘導(dǎo)率達(dá)到最大為87%，濃度0，0.1，0.5，1 mg/L處理之間誘導(dǎo)差異不顯著(P＞0.05)，但與3，5 mg/L 差異顯著(P＜0.05)。11 月16 日胚，當(dāng)AgNO3濃度為0.5 mg/L 時(shí)，誘導(dǎo)率達(dá)到最大為77%，濃度1 mg/L 與0.1，0.5 mg/L 處理之間差異不顯著(P＞0.05)，與0，3 mg/L 的處理差異顯著(P＜0.05)，而0.1，0.5 mg/L 與0，3 mg/L 處理差異不顯著(P＞0.05)。次年1 月2 日胚，子葉為外植體，當(dāng)AgNO3濃度為0.1 mg/L 時(shí)，誘導(dǎo)率最大為98%，濃度在3 mg/L 范圍內(nèi)，各誘導(dǎo)率差異不顯著(P＞0.05)。

表2 AgNO3對(duì)不同發(fā)育期銀杏胚的愈傷誘導(dǎo)率影響Tab.2 The effect of AgNO3on embryos callus induction of different stages

圖1 銀杏愈傷的不同生長(zhǎng)現(xiàn)象及分化現(xiàn)象Fig.1 Phenomenon of different growth and differentiation on callus

2.3 隔代添加AgNO3對(duì)愈傷組織分化的影響

常規(guī)添加AgNO3的處理，只有低濃度0.1 mg/L 出現(xiàn)芽點(diǎn)的分化(圖1:F)。濃度升高時(shí)，愈傷組織呈墨綠色干枯狀，到3 mg/L 時(shí)，褐化死亡。隔代添加AgNO3后，愈傷生長(zhǎng)發(fā)生變化。表現(xiàn)為隨著濃度的升高，干枯的愈傷組織變得水潤(rùn)有光澤，且出現(xiàn)了不同的分化。1 mg/L 時(shí)，愈傷組織50 d 分化出短細(xì)透明絲狀物，兩瓶共5 塊(圖1:E);90 d 時(shí)1 塊愈傷組織分化出6 個(gè)類似子葉胚的突出體，并排相連生長(zhǎng)(圖1:H、I、J)，另有1 塊愈傷分化出兩片愈傷化銀杏葉，色澤淡綠透明，輪廓清晰(圖1:G)。濃度為1.5 mg/L時(shí)，愈傷組織50 d 分化出透明長(zhǎng)絲狀物，兩瓶共5 塊(圖1:K)。濃度為3 mg/L 時(shí)，50 d 亦有一瓶出現(xiàn)絲狀突起，共2 塊，另有2 塊出現(xiàn)圓球突起并聯(lián)生長(zhǎng)，色澤淡綠透明，表皮光滑有光澤(圖1:L);在90 d 時(shí)，分化出短小葉狀突起，干褐(圖1:M)。

2.4 避光處理對(duì)AgNO3作用的影響

對(duì)AgNO3采取兩種遮光方式，結(jié)果出現(xiàn)差異。暗處理中，由表3 可知各濃度AgNO3對(duì)愈傷的誘導(dǎo)率及愈傷程度影響差異不顯著(P＞0.05)，均在80%左右，誘導(dǎo)率高于光照培養(yǎng)，愈傷程度基本相同。其中，未添加AgNO3的處理愈傷組織較大且疏松，呈現(xiàn)出透明愈傷包裹黃色愈傷的特點(diǎn)(圖1:O)。添加AgNO3的處理中愈傷稍小，黃白透明，表面有毛狀突起。

在活性炭處理中，胚軸形成愈傷而子葉只輕微膨大，二者差異明顯，能被輕易分開(kāi)。由表4 可知，添加AgNO3后，胚軸在濃度0.1 mg/L 與0.5 mg/L 出現(xiàn)白色透明細(xì)膩愈傷組織(圖1:N)，該組織對(duì)外界環(huán)境敏感，如不及時(shí)繼代(15 d)，則比普通愈傷褐化死亡快，其誘導(dǎo)率隨Ag+濃度升高而降低，高濃度(≥1 mg/L)AgNO3顯著抑制其誘導(dǎo)，當(dāng)濃度為3 mg/L 時(shí)，胚難以誘導(dǎo)出愈傷，進(jìn)而萌發(fā)出正常銀杏苗。

表3 暗培養(yǎng)愈傷誘導(dǎo)的影響Tab.3 The effect of dark cultivation on callus induction

表4 活性炭對(duì)愈傷誘導(dǎo)的影響Tab.4 The effect of AC on callus induction

3 結(jié)論與討論

銀杏快繁，面臨著分化率低、生根困難和褐化嚴(yán)重3 個(gè)難題［2，10-11］。有研究發(fā)現(xiàn)AgNO3可促進(jìn)外植體分化，控制褐化，抑制黃化。因Ag+與乙烯競(jìng)爭(zhēng)受體蛋白成為乙烯釋放的抑制劑，而乙烯和多胺中的某些胺類競(jìng)爭(zhēng)底物S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，含量此消彼長(zhǎng)［8，12-13］。封閉的組培瓶中積累大量乙烯，AgNO3能降低乙烯的含量，提高外植體中多胺的合成，而多胺對(duì)不定芽和體胚的分化有促進(jìn)作用［7］。在牡丹組培中，AgNO3可以降低愈傷褐化率，提高組培苗生長(zhǎng)質(zhì)量［14，15］。在中華結(jié)縷草莖尖培養(yǎng)中，Ag-NO3可抑制其黃化，促進(jìn)生長(zhǎng)［16］。

本研究表明銀杏胚愈傷組織誘導(dǎo)率較高為64%～97%。光照條件下，一定濃度(0～1 mg/L)的AgNO3能提高愈傷誘導(dǎo)率而減緩其增值速度，高濃度(＞3 mg/L)則顯著抑制愈傷的誘導(dǎo)。其中，心形胚魚(yú)雷形胚的誘導(dǎo)率低于成熟胚子葉而高于早期子葉胚，可能是心形胚分化程度為三者中最低，其脫分化的能力高于后兩者，同時(shí)成熟胚子葉的誘導(dǎo)率高于胚軸［6，17-18］，故子葉愈傷誘導(dǎo)率高于全胚。一些研究認(rèn)為不同發(fā)育時(shí)期的胚所含激素、內(nèi)含物的種類和濃度亦會(huì)影響愈傷的誘導(dǎo)與分化［19-20］。植物激素可以通過(guò)影響多胺［12］或DNA 甲基化水平來(lái)調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育［21］。

本研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)方式對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)及分化產(chǎn)生了不同影響。持續(xù)添加AgNO3時(shí)，只有低濃度處理(0.1 mg/L)分化出芽點(diǎn)，高濃度處理則褐化死亡，Ag+屬于重金屬，能競(jìng)爭(zhēng)性的進(jìn)入葉綠素分子，長(zhǎng)期添加導(dǎo)致外植體Ag+中毒，這與Haeyoung 等［22］在甘藍(lán)體胚實(shí)驗(yàn)中的發(fā)現(xiàn)一致。隔代添加AgNO3能降低Ag+的毒害作用，增強(qiáng)愈傷對(duì)高濃度AgNO3的適應(yīng)能力，且促進(jìn)愈傷組織分化:1 mg/L 處理分化出絲狀物、葉片和胚類似物，1.5 mg/L 處理分化出長(zhǎng)絲，3 mg/L 處理分化出葉片和球狀物，但分化比例較低。愈傷組織從啟動(dòng)分化到形成不定芽或體胚是個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，如果分化停滯于中間某個(gè)過(guò)程，僅憑外部形態(tài)的變化來(lái)判斷具有一定的局限性，在研究中常借助于細(xì)胞組織學(xué)手段進(jìn)行觀察。吳元立等［23］通過(guò)石蠟切片發(fā)現(xiàn)成熟銀杏胚25 d 左右便能形成胚性細(xì)胞，最后可發(fā)育至心形胚。盛麗莉等［24］發(fā)現(xiàn)銀杏小子葉胚能形成胚性愈傷，最后發(fā)育至球形胚。本研究中的胚類似物只在一塊愈傷組織上出現(xiàn)，具有偶然性，但通過(guò)上述二人的石蠟切片觀察可知，銀杏幼胚具有誘導(dǎo)胚性愈傷的潛能，本研究中只給出了一種培養(yǎng)基和激素組合，沒(méi)能滿足后續(xù)培養(yǎng)中適宜的分化條件而使分化終止。銀杏組培中，對(duì)處于某一發(fā)育階段但尚未取得突破的愈傷組織或外植體，可利用現(xiàn)有的干燥冷凍技術(shù)進(jìn)行保存，以利于后續(xù)研究［25-26］。

AgNO3在光照下分解為單質(zhì)Ag 和氣體NO2、O2。本研究對(duì)AgNO3進(jìn)行遮光處理發(fā)現(xiàn)，暗培養(yǎng)時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率提高，AgNO3不能對(duì)誘導(dǎo)產(chǎn)生顯著影響?？赡苁钦诠馓幚盹@著增加了愈傷組織誘導(dǎo)率及生長(zhǎng)量，此增長(zhǎng)大過(guò)了Ag+減緩愈傷生長(zhǎng)的能力。而活性炭處理的全胚中，胚軸在低濃度(0.1～0.5 mg/L)處理下形成愈傷組織，子葉只輕微膨大。有學(xué)者認(rèn)為胚軸比子葉對(duì)AgNO3更敏感［8］。胚軸愈傷與膨大子界限明顯，如選用小體積胚的胚軸作外植體時(shí)，添加活性炭培養(yǎng)可輕易將胚軸與子葉分開(kāi)。本研究認(rèn)為活性炭對(duì)AgNO3的吸附量少，且提供的遮光環(huán)境降低了AgNO3的分解程度，以致增強(qiáng)了對(duì)外植體的作用。在含活性炭的培養(yǎng)基中添加AgNO3應(yīng)比光照下適當(dāng)降低濃度。

建立完善的銀杏快繁體系還面臨著眾多難題。AgNO3能促進(jìn)銀杏幼胚愈傷組織的誘導(dǎo)和分化，且隔代添加的方式提高了外植體對(duì)AgNO3的適應(yīng)能力，如在此基礎(chǔ)上，研究培養(yǎng)基、外源激素和培養(yǎng)環(huán)境對(duì)幼胚愈傷組織分化的影響，將會(huì)豐富銀杏再生體系的理論依據(jù)。

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