彭 棋，阮記明，黃冬艷，王自蕊，黃柳梅，熊平文，黃建珍

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西 南昌 330045)

大豆是動(dòng)物重要的蛋白質(zhì)資源，與谷類作物蛋白相比，大豆蛋白質(zhì)具有含量高、氨基酸平衡性好，以及乳化性、吸油性等優(yōu)良的理化性質(zhì)而被廣泛應(yīng)用于食品業(yè)、醫(yī)藥業(yè)和動(dòng)物飼料等多個(gè)領(lǐng)域［1-3］。而在大豆蛋白質(zhì)中，大豆球蛋白占50%～90%。大豆蛋白主要由2S、7S、11S、15S 這4 種組分組成，其中7S球蛋白和11S 球蛋白是大豆蛋白的主要成分［4］。研究表明，11S 和7S 組分在理化性質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)功能特性方面均有很大差異［5］。7S 大豆球蛋白與11S 球蛋白一樣含有低量的含硫氨基酸，這相對(duì)降低了大豆貯藏蛋白的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值;與11S 球蛋白相比，7S 大豆球蛋白含有的巰基和二硫鍵較少導(dǎo)致其凝膠保水性和黏結(jié)性較差，而含有的賴氨酸和疏水性氨基酸較多導(dǎo)致其具有較強(qiáng)的表面活性、較好的溶解性、乳化性與穩(wěn)定性。然而，11S 大豆球蛋白與7S 球蛋白在液泡型蛋白體的共同蓄積狀態(tài)增加了該類蛋白的提純難度［6］，因此對(duì)大豆球蛋白的分離提取分析對(duì)于大豆蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的研究具有重要意義。

截至目前，一些學(xué)者報(bào)道了一些關(guān)于大豆球蛋白提取分離的方法［7］，如超速離心、低溫沉淀、等電點(diǎn)沉淀、鹽析、膜分離和層析分離等，但試驗(yàn)步驟比較繁瑣，不太適合大規(guī)模生產(chǎn)。本研究以大豆為原材料，探討了在不同提取液、不同pH、不同溫度、不同濃度及不同料液比對(duì)大豆球蛋白提取的影響，并參考Xiao Ru［8］介紹的方法將大豆球蛋白7S 和11S 亞基進(jìn)行分離提取及進(jìn)一步分析。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及材料

1.1.1 試驗(yàn)材料與試劑 大豆由江西某飼料公司惠贈(zèng);丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸鈉、過硫酸銨、四甲基乙二胺、考馬斯亮藍(lán)G-250 均購(gòu)自Amresco;低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白購(gòu)自中科院上海生化研究所;無水丙酮等試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器 24DN 制膠器購(gòu)自北京市六一儀器廠;DYY-7C 型電泳儀購(gòu)自北京市六一儀器廠;透析袋購(gòu)自上海生物化學(xué)研究所;PHS-3C 型精密pH 計(jì)購(gòu)自上海雷磁儀器廠;TGL-16G-A 高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自上海儀器廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大豆脫脂豆粉的制備 豆粕采用PolymixA10 高速粉碎機(jī)粉碎，并過80 目篩，用丙酮脫脂3 次，抽濾，風(fēng)干，即得脫脂豆粉，-20 ℃保存。

1.2.2 大豆球蛋白及2S 和11S 亞基的提取(1)不同種類提取液對(duì)大豆球蛋白提取的影響。采用pH8.5 的PBS 溶液和0.05 mol/L、pH9.0 的Tris-HCl 溶液作為大豆球蛋白的提取液，料液比為1∶10提取大豆球蛋白，在55 ℃的條件下放置2 h 后，以9 000×g 離心30 min，提取上清液。

(2)不同pH 提取液對(duì)大豆球蛋白提取的影響。采用0.05mol/L 的Tris-HCl，使用pH 計(jì)，濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH，分別為6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0 在55 ℃料液比為1∶10 的條件下放置2 h，以9 000×g 離心30 min，提取上清液。

(3)不同溫度對(duì)大豆球蛋白提取的影響。采用0.05 mol/L、pH9.0 的Tris-HCl 溶液作為大豆球蛋白的提取液，料液比為1∶10 提取大豆球蛋白，在25、35、45、55 ℃的條件下分別放置2 h 后，以9 000×g 離心30 min，提取上清液。

(4)不同濃度的Tris-HCl 提取液對(duì)大豆球蛋白提取的影響。采用0.01、0.03、0.05、0.10、0.20 mol/L，pH9.0 的Tris-HCl 溶液作為大豆球蛋白的提取液，料液比為1∶10，在55 ℃的保溫箱內(nèi)放置2 h，9 000×g 離心30 min，提取上清液。

(5)不同料液比對(duì)大豆球蛋白提取的影響。采用0.05 mol/L、pH9.0 的Tris-HCl 溶液作為大豆球蛋白的提取液，料液比為1∶10、1∶12、1∶15、1∶18、1∶20 提取大豆球蛋白，在55 ℃的保溫箱中放置2 h 后，9 000×g 離心30 min，提取上清液。

(6)7S 伴大豆球蛋白和11S 球蛋白的分離提取方法參考文獻(xiàn)［8］。

1.2.3 大豆球蛋白的檢測(cè) 采用SDS-PAGE 電泳鑒定分離大豆球蛋白。取20 μL 上清液進(jìn)行上樣電泳，濃縮膠濃度為5%，分離膠的濃度為10%。恒壓電泳(濃縮膠80 V、分離膠115 V)，當(dāng)溴酚藍(lán)距膠底部5 mm 時(shí)，停止電泳。用考馬斯亮藍(lán)染色液對(duì)膠進(jìn)行染色8 h，脫色2 h，直至背景無色后，用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)凝膠進(jìn)行掃描并分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種類提取液對(duì)大豆球蛋白提取的影響

從圖1 可以看出，用這兩種提取液地提取效果都比較好，pH9.0 的PBS 溶液能夠更好的解離出大亞基，而pH9.0 的Tris-HCl 溶液對(duì)大、小亞基的溶解效果都比較好，所以本試驗(yàn)采用的是Tris-HCl 作為大豆球蛋白的提取液。

圖1 不同提取液的SDS-PAGE 電泳圖譜Fig.1 SDS-PAGE pattern of soybean GLObulin extracted by different extracting solution

圖2 不同PH 提取液提取大豆球蛋白的SDS-PAGE 電泳圖譜Fig.2 SDS-PAGE pattern of soybean GLObulin extracted by the solution of different extracting pH

2.2 不同pH 提取液對(duì)大豆球蛋白提取的影響

從圖2 可以看出，隨著Tris-HCl 的pH 逐漸增大，電泳的條帶越深，說明大豆球蛋白的提取程度提高了。在pH 為9.0 時(shí)，再繼續(xù)提高溶液的pH，大豆球蛋白的溶解度沒有增高，說明提取大豆球蛋白比較適合的pH 為9.0。

2.3 不同料液比對(duì)大豆球蛋白提取的影響

從圖3 可以看出料液比為1∶18 和1∶20 基本上沒有提取到多少球蛋白，料液比為1∶15、1∶12、1∶10能夠提取到大部分的球蛋白，綜合分析合適料液比為1∶10。

圖3 不同料液比提取大豆球蛋白的SDS-PAGE 的電泳圖譜Fig.3 SDS-PAGE pattern of soybean GLObulin extracted by solution of different sample-solution ratio

圖4 不同濃度提取液提取大豆球蛋白的SDS-PAGE 的電泳圖譜Fig.4 SDS-PAGE pattern of soybean GLObulin extracted by solution of different solution concentration

2.4 不同濃度的Tris-HCl 提取液對(duì)大豆球蛋白提取的影響

從圖4 可以看出，隨著提取液濃度的升高，大豆球蛋白的溶解度也升高。在提取液為0.01 mol/L和0.03 mol/L 的情況下，基本上沒有提取到大豆球蛋白，0.05 mol/L 對(duì)大豆大小亞基提取量都比較高，0.1 mol/L 和0.2 mol/L 的提取液對(duì)小亞基的提取程度比較高而對(duì)大亞基的提取量比較低。綜合分析提取大豆球蛋白的Tris-HCl 合適體積分?jǐn)?shù)為0.05 mol/L。

2.5 不同溫度對(duì)大豆球蛋白提取的影響

從圖5 可以看出，25 ℃～55 ℃溫度段，隨著溫度的提高大豆球蛋白的溶解度逐漸增大，所以綜合各因素考慮可得在55 ℃時(shí)提取率比較高。

圖5 不同溫度提取液提取大豆球蛋白的SDS-PAGE 的電泳圖譜Fig.5 SDS-PAGE pattern of soybean GLObulin extracted by solution of different temperature

圖6 7S 伴大豆球蛋白和11S 球蛋白粗提物的SDS-PAGE 電泳圖譜Fig.6 SDS-PAGE pattern of extraction of 7-conglycinin GLObulin and 11S GLObulin

2.6 7S 伴大豆球蛋白和11S 球蛋白粗提物的SDS-PAGE

將伴大豆球蛋白和11S 球蛋白回收液與樣品緩沖液1∶1 混合，上樣電泳(電泳條件如1.2.3)，電泳結(jié)果見圖6。從圖6 可以看出，7S 伴大豆球蛋白和11S 球蛋白得到了較好的分離。

2.7 7S 伴大豆球蛋白和11S 球蛋白分子量的確定

根據(jù)(圖6)標(biāo)準(zhǔn)蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量與遷移率呈線性關(guān)系，我們通過Excel2003 軟件做了以下曲線(圖7):

圖7 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的分子量(Mr)與相對(duì)遷移率(Rf)的關(guān)系曲線Fig.7 Relationship between Rf and lgMr of stander protein

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量與遷移率的線性關(guān)系曲線得到:y=-0.909 3x+5.054 3(R2=0.99)。根據(jù)相對(duì)遷移率計(jì)算后得出7S 伴大豆球蛋白的三個(gè)亞基α’、α、β 的分子量分別是60 466 Da、55 029 Da、49 043 Da;11S 球蛋白的3 個(gè)亞基A3、A、B 的分子量分別為44 634 Da、39 779 Da 和17 952 Da。

3 結(jié)論與討論

綜合大豆球蛋白得率、蛋白含量、純度和亞基含量以及相互作用等分析結(jié)果，大豆球蛋白在55 ℃、0.05 mol/L、pH9.0 的Tris-HCl 溶液且料液比為1∶10 浸提2 h 能夠提取較多的球蛋白，并且7S 伴大豆球蛋白由3 個(gè)亞基組成，其分子量分別為60 466 Da，55 029 Da 和49 043 Da，11S 球蛋白也由3 個(gè)亞基組成，其分子量分別44 634 Da，39 779 Da 和17 952 Da。這與之前學(xué)者所得到的結(jié)果略有出入［9］，由于對(duì)7S 伴大豆球蛋白和11S 球蛋白的分離、提純是相對(duì)的，再加上測(cè)定方法和測(cè)試材料的差異性，使得7S 伴大豆球蛋白和11S 球蛋白組分各個(gè)亞基的相對(duì)分子質(zhì)量尚缺乏統(tǒng)一的結(jié)論，但仍然可以作為后續(xù)研究作參考。許多試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)大豆球蛋白溶解性的影響因素是大豆球蛋白與蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)與水之間的相互作用的平衡［8］。其中內(nèi)在因素包括疏水作用力［10］，氫鍵作用等［11］;外在因素包括pH［12］、鹽的種類［12］和離子強(qiáng)度［13］等。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，雖然本試驗(yàn)采用pH 都為9.0 的PBS 溶液和Tris-HCl 溶液作為大豆球蛋白的提取液，雖然PBS 溶液對(duì)球蛋白大亞基的提取程度稍微高一點(diǎn)，這可能是PBS 溶液當(dāng)中一定濃度離子增加了亞基的溶解度的原因，但是Tris-HCl 對(duì)大豆球蛋白的大小亞基的提取程度都比較高。

影響球蛋白溶解的一個(gè)重要的原因包括溶液的pH，本實(shí)驗(yàn)觀察到pH 從7.0 升高到9.0 時(shí)，大豆球蛋白的溶解度不斷增加，當(dāng)增加到9.0 時(shí)，溶解度不再增加，所以本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為大豆球蛋白浸提液pH 為9.0的提取效果比較好。一些研究表明，大豆球蛋白浸提液Tris-HCl 的合適pH 為8.5［6］，原因可能是不同地區(qū)的大豆本身有一定的差別，但本實(shí)驗(yàn)與其他的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相差不是很大，仍可以為今后的研究提供重要的參考依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)按照3.1 及3.2 得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定提取液為pH9.0 的Tris-HCl，再改變提取液的料液比。從圖3 可以看出，料液比為1∶18 和1∶20 提取率低，而料液比為1∶15、1∶12、1∶10 提取率高，并且1∶10的料液比大豆球蛋白的提取率最高。而且過高的料液比在實(shí)際生產(chǎn)和實(shí)驗(yàn)室操作中會(huì)降低處理能力，綜上本試驗(yàn)認(rèn)為料液比為1∶10 提取效果最佳。

一些研究表明0.03～0.06 mol/L 的Tris-HCl 緩沖系統(tǒng)能夠提取到大量的球蛋白［6］，因?yàn)榇蠖骨虻鞍讜?huì)因溶液的離子強(qiáng)度變化發(fā)生分子聚合解離作用，即大豆球蛋白具有締合—解離反應(yīng)。在0.1 mol/L 離子強(qiáng)度和中性pH 值下，大豆球蛋白會(huì)聚合成其他蛋白;而在低離子濃度和弱堿性條件下，能解離成其他組分，即增加了溶解度［5-6］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明在Tris-HCl 的濃度為0.05 mol/L 時(shí)球蛋白大小亞基的提取率最高。當(dāng)提取液體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加到0.1 mol/L 時(shí)，雖然球蛋白的小亞基提取率增加，但對(duì)球蛋白大亞基的溶解有一定的抑制作用，同時(shí)還增加了浸提液的成本。

研究表明，在大豆球蛋白的分離過程中，在溫度為80 ℃以下，得率會(huì)隨溫度上升皆呈上升趨勢(shì)［14］。但是，本試驗(yàn)所得的結(jié)果是在25 ℃～55 ℃時(shí)，隨著溫度的升高，大豆球蛋白的得率也會(huì)不斷增加，在55 ℃時(shí)最高，所以認(rèn)為在55 ℃時(shí)提取效果比較好。本試驗(yàn)認(rèn)為雖然隨著溫度的升高，大豆蛋白的溶解度會(huì)適當(dāng)增加，但是溫度太高的話，會(huì)使得蛋白質(zhì)發(fā)生變性，這樣大豆蛋白的得率會(huì)降低。

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