楊 宙，康美花，劉建華，裴冬蓮，張標金，張曉寧，曹豐生*

(1.江西省農業(yè)科學院 水稻研究所/水稻國家工程實驗室(南昌)，江西 南昌 330200;2.江西省農業(yè)科學院 農產品質量安全與標準研究所，江西 南昌 330200)

水稻是亞洲國家的主要糧食作物，對其造成危害的昆蟲超過200 種，其中的5 種主要害蟲分別是鱗翅目的螟蟲和同翅目的飛虱［1］。鱗翅目的主要害蟲是三化螟、二化螟和稻縱卷葉螟，每年都造成巨大的損失。在我國南方的雙季稻種植區(qū)，晚稻一般在7 月份移栽，其分蘗期和抽穗期適逢這3 種螟蟲發(fā)生的高峰，受到的危害更為嚴重。隨著植物基因工程的發(fā)展，許多Bt 基因被導入水稻中，成功地獲得了對這3 種螟蟲具有抗性的轉基因品系，并進行了一些田間試驗和安全性評價。本研究中所轉育的cry1Ab/Ac 是一個融合的Bt 基因，已經被證實能在水稻中高效地表達并發(fā)揮作用［2］。

原始的轉基因水稻材料農藝性狀會受到影響，難以直接應用于農業(yè)生產。因此，需要通過常規(guī)育種方法將抗蟲基因導入栽培品種中進行改良，而抗蟲基因在這一過程中的遺傳和表達是實現育種目標的重要因素。諸多研究表明，轉入水稻的外源基因能在雜交后代中穩(wěn)定地遺傳和表達，為抗蟲基因的應用提供了廣闊的前景［3-4］。外源基因轉入植物后，其表達必然要消耗物質和能量，對植物其它性狀的表現產生不利的影響。外源基因的表達產物還可能有多效性，影響植物的結構特點和代謝途徑［5-6］。有研究表明，將Bt 基因轉入棉花后，植株對鉀離子的吸收和轉運能力發(fā)生了改變［7］。目前還不能確定Bt 蛋白對水稻植株有負面影響，但Bt 水稻農藝性狀的變異是普遍存在的，這些變異與Bt 基因表達水平之間的關系還有待闡明。

本研究以轉cry1Ab/Ac 的秈稻品系TT51 為供體，與多個恢復系雜交。通過分子檢測和抗蟲性觀察，檢驗抗蟲基因在雜交后代中的遺傳規(guī)律。然后測定不同遺傳背景下的Bt 基因表達水平，分析其對抗蟲性和農藝性狀的影響，旨在為利用雜交轉育培育優(yōu)質高產的抗蟲水稻提供依據。

1 材料與方法

1.1 親本材料

雜交的父本轉基因品系TT51 由華中農業(yè)大學提供，是通過基因槍法將Bt 融合基因cry1Ab/Ac 導入秈稻恢復系明恢63 后得到的。母本材料有10 個，分別是廣恢998、先恢207、R163、R288、R451、G11012、G11112、G11553、G11796 和G11995。其中前5 個是目前國內育成并廣泛應用的恢復系，其余5個是本課題組育成的恢復系材料。

1.2 雜交與選擇

在水稻的抽穗開花期將母本植株上未授粉的穎花人工去雄，然后取父本的花粉授粉，套袋至成熟后收獲。PCR 分子檢測取水稻葉片，用CTAB 法抽提總DNA 作為模板，用針對cry1Ab/Ac 基因的特異引物擴增。擴增引物為Cry1A-F 和Cry1A-R，引物序列以及反應體系和程序參考相關的文獻［8］。擴增片段為494 bp，通過8 g/L 的瓊脂糖凝膠電泳分離，染色后在紫外光下觀察。

利用PCR 檢測在F1代去除假雜種，在F2代檢驗外源基因的分離比，每個F2代群體檢測40 個單株。選擇轉基因陽性的F2代單株收種，并自交加代。在F3代考察單株的抗蟲性，選擇農藝性狀良好的抗性單株收種。在F4代篩選出10 種雜交組合的轉基因純合株系和對應的陰性株系，用于Cry1Ab/Ac 蛋白含量的測定和后續(xù)的田間試驗。

1.3 Cry1Ab/Ac 蛋白含量測定

水稻中Cry1Ab/Ac 蛋白含量用上海佑隆生物科技有限公司的Cry1Ab/Ac 酶聯免疫定量檢測(ELISA)試劑盒測定。每個株系選4 個單株，在分蘗期取葉片，拔節(jié)期取莖稈。稱取約10 mg 樣品，用0.5 mL 的抽提液研磨成勻漿，靜置30 min 后吸取上清液，稀釋一定的倍數用于測定。ELISA 測定的操作過程參考說明書，反應結束后用法國生物梅里埃公司的SH1000 型酶標儀讀取450 nm 波長下的吸光度值。繪制標準曲線，在上面讀出待測樣品的蛋白濃度，計算水稻組織的蛋白含量。不同株系的Cry1Ab/Ac 蛋白含量用成組數據的t 測驗進行比較。

1.4 田間抗性評價

2013 年，筆者在位于南昌縣廣福鎮(zhèn)的轉基因試驗基地對轉基因水稻的抗蟲性進行了評價。參試的水稻材料有12 個，分別是敏感對照明恢63、抗性對照TT51 以及10 個雜交組合的純合株系。水稻材料于5 月下旬播種，6 月下旬移栽。田間試驗按照隨機區(qū)組設計，3 個重復，每個小區(qū)種植兩行共20 單株。采用常規(guī)的水肥管理，不防治螟蟲，做自然發(fā)蟲處理。在水稻的分蘗盛期調查卷葉數，拔節(jié)期調查分蘗數和枯心數，計算枯心率。調查數據用SPSS12.0 軟件統計分析，通過LSD 法的t 測驗來檢驗各轉育株系與親本TT51 之間抗性差異的顯著性。

1.5 田間農藝性狀考察

2013 年，筆者在轉基因試驗基地的其它田塊中對各水稻株系的農藝性狀進行了考察。參試的水稻材料有20 個，分別是10 個雜交組合的純合株系及對應的陰性株系。田間試驗的設計與前面相同，不同的是每個小區(qū)的兩行中1 行為純合株系，另1 行為其對應的陰性株系。采用常規(guī)的水肥管理，噴灑殺蟲劑，防治螟蟲危害。成熟后測量水稻的株高，然后收獲考察穗長、每穗粒數、結實率、千粒質量和單株產量。用成對數據的t 測驗來檢驗各純合株系相對其陰性株系農藝性狀差異的顯著性。

2 結果與分析

2.1 雜交轉育后代的檢測和篩選

在PCR 分子檢測中，F2代單株出現轉基因陽性和陰性兩種表型(圖1)。統計了10 個F2代群體中的陽性和陰性植株的數目，并對這兩種植株的總數進行了分析，經X2檢驗都符合3∶1 的比例，說明cry1Ab/Ac 基因在雜交轉育后代中是按照孟德爾規(guī)律遺傳的(表1)。

圖1 F2代植株的PCR 檢測Fig.1 PCR analysis of the F2plants

表1 cry1Ab/Ac 基因在F2代群體中的分離Tab.1 Segregation of cry1Ab/Ac gene in the F2populations

2.2 純合株系中的Cry1Ab/Ac 蛋白含量

Cry1Ab/Ac 蛋白在親本TT51 葉片中的濃度為17.0 μg/g 鮮質量，在各轉育株系中為9.7～17.2 μg/g 鮮質量，有6 個株系顯著降低。Cry1Ab/Ac 蛋白在TT51 莖稈中的濃度為3.02 μg/g 鮮質量，在各轉育株系中為1.30～3.12 μg/g 鮮質量，有4 個株系顯著降低(表2)。葉片與莖稈之間蛋白含量的相關系數為0.775，計算結果表明二者呈極顯著正相關。

表2 葉片和莖稈中的Cry1Ab/Ac 蛋白含量Tab.2 Concentration of Cry1Ab/Ac protein in leaf and stem

2.3 純合株系在田間的抗蟲性

在田間自然發(fā)蟲的條件下，敏感對照明恢63 單株卷葉數為5.43，枯心率為19.37%，受螟蟲危害較嚴重?？剐詫φ誘T51 單株卷葉數僅為0.57，枯心率為2.27%，基本沒有受到蟲害的影響。7 個純合株系的抗蟲性表現與TT51 一樣，另外3 個株系的單株卷葉數和枯心率比TT51 極顯著地增加(表3)。但是與明恢63 相比，它們受害的程度仍然很輕微。

表3 純合株系所受的螟蟲危害Tab.3 Damage symptoms caused by pests on homozygous lines

2.4 純合株系的農藝性狀

在防治螟蟲的處理下，所有的株系都沒有出現卷葉和枯心。經過了3 代篩選，各株系的群體表現趨于一致和穩(wěn)定，農藝性狀相對于親本TT51 都得到了一定程度的改良。其中G11012/TT51、G11553/TT51 和G11995/TT51 這3 個株系的結實率接近90%，R288/TT51、R451/TT51 和G11796/TT51 的單株產量接近或超過30 g，株葉形態(tài)優(yōu)良，展現出了較好的應用潛力(表4)。

與對應的陰性株系相比，大部分轉基因純合株系的農藝性狀較差，株高變矮，產量降低。變異較為普遍的性狀是株高、千粒質量和單株產量，穗粒數和結實率的變異只發(fā)生在少數株系中。結合cry1Ab/Ac 基因的表達水平分析發(fā)現，蛋白含量較高的7 個株系中有6 個植株變矮，千粒質量降低，5 個株系的單株產量顯著低于對應的陰性株系。G11553/TT51、G11796/TT51 和G11995/TT51 這3 個蛋白含量較低的株系農學性狀變異較少(表4)。這些結果表明cry1Ab/Ac 基因的表達對水稻的株高、千粒質量和單株產量有較大的影響。

表4 純合株系的農藝性狀及其變異Tab.4 Agronomic traits and variations of homozygous lines

3 討論與結論

轉基因過程中，外源基因通過異常重組整合到水稻的基因組上，在部分家系中可能不按照孟德爾規(guī)律分離，甚至會隨著世代的增加而丟失［9］。TT51 是經過篩選，被證明外源基因按照孟德爾規(guī)律遺傳的轉基因家系。10 個F2代群體中的陽性和陰性植株以及這兩種植株的總數按照3∶1 分離，說明cry1Ab/Ac 基因也能在這些雜交轉育后代中穩(wěn)定地遺傳，與其它類似研究的結論是一致的［10-11］。

Bt 基因在植物中的表達水平與多種因素有關，如載體的表達元件，轉基因插入位點，植物的遺傳背景、組織器官和發(fā)育階段等［12］。本研究中各株系葉片和莖稈中cry1Ab/Ac 基因表達水平差異很大，前者的蛋白含量是后者的5 倍左右，這主要是由葉片和莖稈不同的組織結構和生理功能引起的。取樣是在水稻的營養(yǎng)生長期，葉片作為主要的光合作用器官，蛋白質合成旺盛并迅速積累。而莖稈主要由輸導組織和機械組織構成，負責物質的運輸和支撐水稻結構，Bt 蛋白難以在其中形成較高的濃度。株系之間cry1Ab/Ac 基因表達水平差異也較大，多個轉育后代的葉片和莖稈Bt 蛋白含量與親本TT51 相比顯著降低，最多的相差2 倍以上。各株系的Bt 基因表達元件和插入位點，以及取樣的組織和時期都相同，因此表達水平的差異應該歸結于遺傳背景的不同。Bt 基因表達水平除受植物物種影響外，在相同物種的不同品種間也會存在差異［13］。這里Cry1Ab/Ac 蛋白含量極顯著降低的株系是G11553/TT51、G11796/TT51 和G11995/TT51，其中的母本G11553 帶有部分粳稻血緣，G11796 和G11995 帶有部分野生稻血緣。因此，筆者推測雙親之間遺傳背景差異較大會抑制Bt 基因在雜交后代中的表達。

cry1Ab/Ac 基因編碼的是Cry1A 類的蛋白，對鱗翅目昆蟲的毒性很強，已經在多種商業(yè)化種植的作物中發(fā)揮作用。部分株系的Cry1Ab/Ac 蛋白含量顯著降低，葉片中最低為8.3 μg/g，莖稈中最低為1.3 μg/g。但是出現的枯心和卷葉很少，產量的損失幾乎可以忽略。這說明較低的Cry1Ab/Ac 濃度仍然能夠有效地防治螟蟲，對轉基因家系的選擇可以在更寬的Bt 蛋白濃度范圍內進行。

轉基因純合株系和陰性株系的遺傳背景基本相同，主要的差別在于轉基因插入位點上。cry1Ab/Ac基因的插入并沒有引起水稻內源功能基因的失活，而轉化過程產生的體細胞變異在陽性和陰性株系中共同存在，所以二者農藝性狀之間的差異主要歸因于cry1Ab/Ac 基因的表達。結合表2 和表4 進行分析，發(fā)現蛋白含量較高的株系株高和千粒質量的變異較大，并最終影響了產量。因此，在滿足抗性所需Bt 蛋白濃度的前提下，可以注重對農藝性狀的考察，選擇蛋白濃度適量且性狀優(yōu)良的轉基因株系作為育種的親本。本研究中轉育得到的部分株系抗蟲性良好，農藝性狀變異小，在水稻育種中具有廣泛應用的潛力。

［1］Chen M，Shelton A，Ye G Y.Insect-resistant GM rice:ten years of field testing in China［J］.Annual Review Entomology，2011(56):81-101.

［2］Tu J M，Zhang G A，Datta K，et al.Field performance of transgenic elite commercial hybrid rice expressing Bacillus thuringiensis δ-endotoxin［J］.Nature Biotechnology，2000，18(10):1101-1104.

［3］Peng J Y，Kononowicz H，Hodges T K.Transgenic indica rice plants［J］.Theoretical and Applied Genetics，1992，83(6/7):855-863.

［4］Chen H，Tang W，Xu C G，et al.Transgenic indica rice plants harboring a synthetic cry2A*gene of Bacillus thuringiensis exhibit enhanced resistance against lepidopteran rice pests［J］.Theoretical and Applied Genetics，2005，111(7):1330-1337.

［5］Bergelson J，Purrington C B，Palm C J，et al.Costs of resistance:a test using transgenic Arabidopsis thaliana［J］.Proceedings of Biological Sciences，1996，263(1377):1659-1663.

［6］Saxena D，Stotzky G.Bt corn has a higher lignin content than non-Bt corn［J］.American Journal of Botany，2001，88(9):1704-1706.

［7］Zhang M，Wang X C，Yan W D，et al.K+and Na+uptake and transport and SOD activity in Bt transgenic cotton seedlings under salt stress［J］.Acta Pedologica Sinica，2005，42(3):460-467.

［8］Yang Z，Chen H，Tang W，et al.Development and characterisation of transgenic rice expressing two Bacillus thuringiensis genes［J］.Pest Management Science，2011，67(4):414-422.

［9］華志華，黃大年.轉基因植物中外源基因的遺傳學行為［J］.植物學報，1999，41(1):1-5.

［10］崔海瑞，王忠華，舒慶堯，等.轉Bt 基因水稻克螟稻雜交轉育后代農藝性狀的研究［J］.中國水稻科學，2001，15(2):101-106.

［11］柳絮，王文英，李軍，等.利用回交轉育培育黃淮稻區(qū)抗蟲轉基因水稻新品系［J］.山東農業(yè)科學，2013，45(1):38-41.

［12］盧美貞，崔海瑞，姚艷玲，等.影響蘇云金芽孢桿菌基因在轉基因植物中表達的因素［J］.細胞生物學雜志，2005，27(5):509-513.

［13］耿軍義，張香云，王兆曉，等.Bt 基因在不同陸地棉基因型的表達研究［J］.棉花學報，2003，15(1):8-12.