張吉鹍，張震宇，吳文旋，李龍瑞，鄒慶華

(1.江西省農(nóng)業(yè)科學院 畜牧獸醫(yī)研究所，江西 南昌 330200;2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 動物科學學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018;3.貴州大學 動物科學學院，貴州 貴陽 550025;4.江西新天地藥業(yè)有限公司獸藥研究院，江西 峽江 331400)

進入反芻動物小腸中的氨基酸主要由瘤胃微生物蛋白質(zhì)(30～100%)、瘤胃非降解飼料蛋白質(zhì)(0～70%)和內(nèi)源蛋白質(zhì)(0～10%)組成。其中微生物蛋白質(zhì)是進入小腸氨基酸的主要來源［1］。研究表明在可降解氮源和可發(fā)酵有機物比例適當、數(shù)量充足的情況下，瘤胃微生物能合成足以維持正常牛生長和生產(chǎn)(如一定產(chǎn)奶量)的蛋白質(zhì)，且十二指腸食糜的氨基酸組成往往與微生物蛋白的氨基酸組成相似［2］。由此可見微生物蛋白對十二指腸食糜氨基酸的重要性。因此，研究如何充分利用反芻動物蛋白質(zhì)營養(yǎng)特點，使達到十二指腸的微生物蛋白質(zhì)最多，對有效調(diào)控反芻動物蛋白質(zhì)營養(yǎng)、節(jié)約蛋白質(zhì)飼料有重要意義。由于瘤胃原蟲對細菌的吞噬，使得瘤胃微生物蛋白對十二指腸的貢獻率下降［3-5］。長期以來，對瘤胃原蟲在瘤胃內(nèi)蛋白無效循環(huán)的研究中，更多關注于原蟲的存留與否對供給小腸微生物蛋白的多寡以及對宿主生產(chǎn)性能的影響［6-10］，而反芻動物低質(zhì)基礎日糧補飼優(yōu)質(zhì)牧草對瘤胃原蟲吞噬細菌作用的組合效應則鮮見報道。山羊稻草基礎日糧補飼適量的苜蓿，由于飼料間的組合效應，改善了瘤胃動力學參數(shù)，提高了稻草在瘤胃的發(fā)酵率、消化道各部位營養(yǎng)物質(zhì)流通量與消化率以及微生物蛋白的合成效率、增加了十二指腸氨基酸流量與山羊氮的沉積率［11-15］，但稻草補飼苜蓿對山羊瘤胃內(nèi)蛋白微循環(huán)的影響卻知之甚微，而該點正是能夠明確查明瘤胃微生物蛋白內(nèi)循環(huán)損失的關鍵。本研究就是要在前述研究基礎上，探討瘤胃原蟲對細菌的吞噬率和細菌氮的吞噬量，從瘤胃蛋白微循環(huán)進一步探討山羊稻草基礎日糧補飼適量苜蓿提高微生物氮利用效率的組合效應機制，同時通過增重試驗對這種組合效應進行驗證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)購于Sigma 公司。

1.1.2 試驗動物 選9 只體況良好，體質(zhì)量相近(41.3±1.2)kg，安裝永久性瘤胃瘺管的成都麻羊半同胞羯羊進行試驗。

1.1.3 試驗用混合粗飼料組成 根據(jù)前期體外批次發(fā)酵的組合效應研究結(jié)果［15］，決定在山羊稻草基礎日糧中分別補飼25%、50%與75%的苜蓿，也就是將稻草與苜蓿干草(MSL)分別以體積比為75∶25(MSL25)、50∶50(MSL50)與25∶75(MSL75)的比例組成3 個混合粗飼料，并制成草塊，MSL25、MSL50 與MSL75 的混合粗飼料干物質(zhì)中營養(yǎng)成分分析結(jié)果見表1，有關試驗用飼料營養(yǎng)價值的詳細評定結(jié)果見“江西幾種奶牛常用飼料的多體系營養(yǎng)價值評定”［16］。

表1 試驗用混合粗飼料干物質(zhì)中營養(yǎng)成分Tab.1 Nutrients of experimental mixed forages

1.1.4 試驗設計 本試驗采用單因子3 處理重復試驗設計，按體重相似和隨機方法將試驗羊只分成3組，每組3 只，分別飼以3 組混合粗飼料，以探討山羊稻草基礎日糧補飼不同水平苜蓿(25%、50%與75%)對山羊瘤胃內(nèi)蛋白微循環(huán)(瘤胃原蟲對細菌的吞噬量)及增重的組合效應。

1.1.5 飼養(yǎng)管理 試驗羊單籠飼養(yǎng)，預試期14 d，正試期45 d，每日于06:00 和18:00 兩次飼喂，自由飲水，常規(guī)光照、驅(qū)蟲與管理。

1.2 測定指標與試驗方法

1.2.1 測定指標 ①瘤胃內(nèi)蛋白微循環(huán)主要測定瘤胃原蟲對細菌的吞噬量，采用王歡莉等［17］的熒光光度法進行，并計算出瘤胃原蟲對細菌的吞噬速率。②增重性能主要測定初始體質(zhì)量、結(jié)束體質(zhì)量與干物質(zhì)采食量(DMI)，并計算出總增重、日增重、DMI/日增重以及單位增重的飼料成本(飼料成本/日增重)。

1.2.2 瘤胃細菌與原蟲的分離 瘤胃液的采集方法詳見“稻草補飼不同水平苜蓿對山羊瘤胃發(fā)酵的組合效應研究”［11］，將采集到的瘤胃液參考Wang［18］的方法對瘤胃細菌與原蟲進行分離:①采集瘤胃液，4 層紗布過濾，取一部分樣品離心(29 000×g，20 min)，收集上清液，制備無菌瘤胃液，4 ℃保存。②其它樣品用于分離細菌與原蟲，離心(150×g，10 min)后，收集原蟲沉淀，并用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS，pH 7.5)洗滌2 次，以無菌瘤胃液懸浸成2 倍濃度的原蟲液。③取以上低速離心的上清液，經(jīng)2 μm 濾膜過濾后，離心(22 000×g，15 min)，沉淀以PBS(pH 7.0)洗滌2 次，離心后以PBS(pH 7.0)懸浸。

1.2.3 DAPI 熒光標記瘤胃細菌 將DAPI 加入細菌懸液染色，37 ℃水浴20 min，離心(22 000×g，15 min)，沉淀用甲醇洗滌1 次，PBS(pH7.0)洗滌2 次，以無菌瘤胃液懸浸成2 倍濃度的熒光標記細菌(fluorescence labeled bacteria，F(xiàn)LB)。

1.2.4 吞噬試驗 將標記細菌液加入等體積的原蟲懸液中，參考王歡莉等［17］的研究結(jié)果，將厭氧培養(yǎng)(39 ℃，50 r/min 搖床)時間分別選定在45 min、60 min 和75 min，并在這些時間點采集樣品，所得樣品加入等體積甲醛固定液，固定30 min，150×g 離心10 min，分離原蟲，上清液用于游離標記細菌的熒光強度測定。

1.2.5 熒光強度測定 采用熒光分光光度計(RF-5301PC，日本島津)，選擇波長Ex=358 nm，Em=461 nm，發(fā)射圖譜掃描范圍340～600 nm，激發(fā)光狹縫寬度5 nm，發(fā)射光狹縫寬度5 nm，測定樣品的熒光強度。

1.3 原蟲對細菌吞噬量的計算

式中:A 為原蟲對細菌的吞噬量(cells/cell);B 為培養(yǎng)液中初始標記細菌熒光強度(Au);C 為不同時間點所測游離標記細菌熒光強度(Au);Ci為標記細菌初始濃度(cells/mL);K 為常數(shù)(340.33 Au);D為原蟲濃度(cells/mL)。

1.4 統(tǒng)計分析

采用Microcal(TM)Origin 6.0 軟件對所測熒光強度值進行整理，試驗數(shù)據(jù)采用Excel 軟件整理，用SAS(6.12)軟件的一般線性模型(GLM)程序進行方差(ANOVA)分析和鄧肯氏多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 瘤胃原蟲對細菌的吞噬量

瘤胃原蟲體外不同吞噬時間對細菌的吞噬量結(jié)果見表2。由表2 可知，瘤胃原蟲在不同吞噬時間對細菌的吞噬量均隨著稻草補飼苜蓿水平的增加而增加，但當補飼量達到稻草基礎日糧的50%時，原蟲對細菌的吞噬量趨于平穩(wěn)，增加或降低均不明顯，MSL50 與MSL75 的結(jié)果相似(P＞0.05)。表明山羊稻草基礎日糧補飼50%的苜?？勺畲蠼档土鑫冈x的吞噬量。就吞噬時間而言，原蟲對標記細菌的吞噬量先上升后下降，以60 min 為拐點。這種態(tài)勢表明，60 min 以前原蟲對細菌的吞噬行為占優(yōu)勢，60 min后主要表現(xiàn)為原蟲對已吞噬細菌的消化。

2.2 瘤胃原蟲對細菌的吞噬速率

經(jīng)計算的瘤胃原蟲體外不同吞噬時間對細菌的吞噬速率結(jié)果見表3。由表3 可知，山羊稻草基礎日糧補飼苜蓿各時間點瘤胃原蟲吞噬細菌的速率，同吞噬量的變化規(guī)律一樣，隨苜蓿補飼水平的增加而減少，到苜蓿補飼量占稻草基礎日糧的50%時，趨于平穩(wěn)，MSL50 與MSL75 的吞噬速率相似(P＞0.05)。就吞噬時間而言，原蟲的吞噬速率在45～60 min 時間段內(nèi)吞噬速率逐漸上升，60 min 時達到高峰，以后逐漸下降。MSL25、MSL50 與MSL75 在60 min 的最大吞噬速率分別為381.91 cells/cell·h、377.02 cells/cell·h 與376.47 cells/cell·h，除MSL50 與MSL75 的組間差異不顯著外，其余組間差異顯著(P＜0.05)。

表2 山羊稻草基礎日糧補飼不同水平苜蓿瘤胃原蟲對細菌吞噬量的組合效應Tab.2 The associative effects of rumen protoza on grazing quantity of bacteria for goats fed with RS basic diet supplemented with 3 different level of MSL(cells/cell)

表3 山羊稻草基礎日糧補飼不同水平苜蓿瘤胃原蟲對細菌吞噬速率的組合效應Tab.3 The associative effects of rumen protoza on grazing rate of bacteria for goats fed with RS basic diet supplemented with 3 different level of MSL(cells/cell·h)

2.3 山羊稻草基礎日糧補飼不同水平苜蓿對增重的組合效應

山羊稻草基礎日糧補飼不同水平苜蓿對增重的組合效應見表4。由表4 可以看出，盡管試驗結(jié)束時3 組混合粗飼料的體質(zhì)量差異不顯著(P＞0.05)，但其總增重、日增重均隨苜蓿補飼水平的增加而顯著增加(P＜0.05)，單位增重所需的飼料也就是山羊干物質(zhì)采食量(DMI)與日增重之比則隨苜蓿補飼水平的增加而降低，MSL50 與MSL75 的組間差異不顯著(P＞0.05)，其余組間差異顯著增加(P＜0.05)，表明隨著苜蓿補飼水平的增加，日糧飼料轉(zhuǎn)化率獲得提高，當補飼水平超過50%時，日糧飼料轉(zhuǎn)化率提高不明顯。每公斤增重所需的飼料成本以MSL75 的最高，為59.01 元/kg，其次為MSL25(58.49元/kg)，二者差異不顯著(P＞0.05)，MSL50 的最低，為48.56 元/kg。MSL75 的每公斤增重所需的飼料成本高，主要是由于苜蓿占的比例較高所致(苜蓿按3.5 元/kg，稻草按0.6 元/kg 計，則每公斤MSL75、MSL50 與MSL25 混合粗飼料的價格分別為2.78 元、2.05 元與1.33 元)，而MSL25 的每公斤增重所需的飼料成本較高，主要是因為MSL25 的日增重較低所致(MSL25 的日增重為861.45g，僅為MSL75 組2 216.85 g 的38.86%)，二者具有本質(zhì)區(qū)別。這也從另一方面證明，在(羊肉價格不好)市場不景氣的條件下，養(yǎng)殖戶常以低質(zhì)粗飼料飼喂山羊，僅補給少量優(yōu)質(zhì)粗飼料甚至不補飼，不僅不能節(jié)約飼料成本，而且增加飼料成本。相反，應該充分利用當?shù)仫暳腺Y源，充分利用飼料間的組合效應，來提高低質(zhì)粗飼料的利用效率，降低飼料成本，確保好的養(yǎng)殖效益。

表4 山羊稻草基礎日糧補飼不同水平苜蓿對增重的影響Tab.4 The associative effects on weight gain of goats fed with RS basic diet supplemented with 3 different level of MSL

3 討論與結(jié)論

3.1 山羊稻草基礎日糧補飼適量苜蓿提高了瘤胃內(nèi)蛋白微循環(huán)效率

飼喂低質(zhì)飼料的反芻動物，全部或部分驅(qū)除原蟲，可增加細菌與真菌的數(shù)量，進而增加纖維的降解率［7，19-21］。因此，有理由認為，山羊稻草基礎日糧補飼苜蓿，降低了原蟲對細菌的吞噬量與吞噬速率，因而亦能增加基礎日糧的消化率，這在“山羊稻草基礎日糧補飼不同水平苜蓿對消化道各部位營養(yǎng)物質(zhì)消化率的影響研究”中得到了驗證。反芻動物瘤胃原蟲不能利用氨氮合成自身的蛋白質(zhì)，只能利用微生物及飼料中的蛋白質(zhì)作為其主要氮源。雖然原蟲也能部分降解蛋白質(zhì)，但其降解的速度特別慢，而細菌還是降解蛋白質(zhì)的主要瘤胃微生物。由于原蟲對細菌的吞噬作用，會導致微生物氮的產(chǎn)量降低，增加宿主動物對蛋白質(zhì)的維持需要，同時由于原蟲在瘤胃內(nèi)的滯留時間長，以及反芻過程與空氣中的氧接觸的機會較多，大部分原蟲由于自溶而死亡，所以原蟲氮很少能進入真胃和十二指腸為宿主所利用。試驗證明，全部［19-20］或部分［7，21］驅(qū)除原蟲可降低飼料和細菌蛋白的降解率，提高微生物氮的產(chǎn)量，增加過瘤胃蛋白的數(shù)量?？梢哉J為，山羊稻草基礎日糧補飼適量苜蓿，由于減少了瘤胃原蟲對細菌的吞噬量，從而提高了瘤胃內(nèi)蛋白微循環(huán)效率，進而提高十二指腸氨基酸流量［14］與氮沉積［12］。本研究瘤胃原蟲在不同時間點對細菌的吞噬量與吞噬速率的變化規(guī)律及結(jié)果與王歡莉等［17］報道的徐淮山羊的結(jié)果相似。

3.2 山羊稻草基礎日糧補飼適量苜蓿提高了增重的經(jīng)濟效益

本研究MSL25、MSL50 與MSL75 的日增重分別為19.14 g/d、40.40 g/d 與49.26 g/d，并未以等比例(以25%的水平)隨苜蓿補飼水平的增加而增加，表明其中存在著組合效應，正是苜蓿的補飼提高了低質(zhì)秸稈粗飼料稻草的利用率。MSL75 的日增重與王旭［22］、張吉鹍［23］先前報道的相似，MSL50 的略低，而MSL25 則僅為2/5。MSL25、MSL50 與MSL75 的單位增重所需的飼料(或曰飼料報酬)分別為44.14、23.69 與21.26，較王旭、張吉鹍先前報道的要高，特別是MSL25 要高出2 倍多，主要是因為王旭、張吉鹍先前報道的是經(jīng)GI(粗飼料分級指數(shù))優(yōu)化的混合粗飼料。這從反面驗證了粗飼料優(yōu)化的重要性及日糧中不重視飼料間的組合效應給養(yǎng)殖利潤造成的損失。盡管苜蓿補飼超過50%后，單位增重所需的飼料趨于平穩(wěn)，MSL50 與MSL75 的差異不顯著(P＞0.05)，但單位增重所需的飼料成本MSL75 較MSL50 卻顯著增加(P＜0.05)，甚至還高于日增重最低的MSL75，表明山羊稻草基礎飼料補飼優(yōu)質(zhì)飼料并不是越多越好，而是要充分利用當?shù)卮诛暳腺Y源，利用飼料間的組合效應提高低質(zhì)粗飼料的利用率，以降低飼料成本，提高養(yǎng)殖效益。

本研究結(jié)果表明，山羊稻草基礎日糧補飼50%的苜?？商岣吡鑫竷?nèi)蛋白微循環(huán)效率，獲得好的增重性能。

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