葉 茂，鄧毛程，張遠(yuǎn)平，李 靜，張東峰

(廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物工程系，廣東廣州510300;廣東高校特色調(diào)味品工程技術(shù)開發(fā)中心，廣東廣州510300)

酵母抽提物(yeast extract，YE)是利用啤酒廢棄酵母及鮮酵母等為原料，通過生物酶解技術(shù)獲得的一類具有醇厚味美的調(diào)味產(chǎn)品。酵母抽提物不但具有強(qiáng)烈的呈味性能，能起到增加食品呈香和味覺的效果，廣泛應(yīng)用于肉制品、干酪烘焙食品、調(diào)味料、湯料、蔬菜和海鮮風(fēng)味產(chǎn)品以及香精香料等行業(yè)中，而且還含有豐富的多肽、氨基酸、核苷酸、B族維生素、礦物質(zhì)、微量元素等，能起到營養(yǎng)和醫(yī)療輔助作用。因此，酵母抽提物是一種兼具調(diào)味、營養(yǎng)和保健三大功能的高級(jí)天然復(fù)合添加劑，具有廣泛的應(yīng)用前景［1-2］。產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)作為一種一般認(rèn)為安全(generally regarded as safe，GRAS)生物，它和啤酒酵母、克魯維酵母被美國食品及藥物管理局(FDA)認(rèn)證為可作為食品添加劑的酵母，也是我國衛(wèi)生部規(guī)定的可用于保健食品的真菌菌種［3］。因此，產(chǎn)朊假絲酵母常常被用于生產(chǎn)多種功能物質(zhì)，是工業(yè)中極為重要的微生物之一。

產(chǎn)朊假絲酵母作為酵母抽提物的原料具有一定的優(yōu)勢(shì)，其所含蛋白質(zhì)和核酸物質(zhì)均高于一般的面包酵母和啤酒酵母，并且酵母味較淡。因此，國外已經(jīng)有產(chǎn)朊假絲酵母為原料的酵母抽提物產(chǎn)品(如，巴西Biorigin、加拿大 Lallemand、日本 Kohjin等)。然而，目前國內(nèi)酵母抽提物生產(chǎn)所用酵母基本都是面包酵母和啤酒酵母的釀酒酵母屬(Saccharomyces cerevisiae)［4］。本文研究內(nèi)容是以產(chǎn)朊假絲酵母為原料的風(fēng)味酵母抽提物制備工藝，所得酵母抽提物可作為風(fēng)味食品的加工原料。這為我國的酵母抽提物企業(yè)開發(fā)新產(chǎn)品提供了一條新思路。

表2 酵母抽提物的感官評(píng)定Table 2 Assessing method of flavor yeast extract

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

產(chǎn)朊假絲酵母(Candiada utilis，No．1769) 中國工業(yè)菌種保藏中心(CICC);木瓜蛋白酶(107U/g)、菠蘿蛋白酶(5×106U/g)、中性蛋白酶(106U/g)、風(fēng)味酶 廣西南寧龐博生物工程有限公司;其他試劑國產(chǎn)分析純。

GJB300-100高壓均質(zhì)機(jī) 常州市均質(zhì)機(jī)械有限公司;HHS水浴振蕩器 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;809型萬通自動(dòng)電位滴定儀 瑞士萬通公司;722N型可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;1100型高效液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 實(shí)驗(yàn)流程 產(chǎn)朊假絲酵母→接種培養(yǎng)→離心收集酵母泥→配制一定濃度酵母懸浮液(并調(diào)節(jié)pH)→NaHCO3預(yù)處理→高壓均質(zhì)破壁→自溶(添加酶制劑)→加熱滅酶活(85℃，15min)→離心分離(6000r/min，10min)→收集上清液→取樣測(cè)定。

1．2．2 提取工藝最優(yōu)參數(shù)的確定 在單因素實(shí)驗(yàn)時(shí)，依次改變提取均質(zhì)壓力、均質(zhì)次數(shù)、溫度、pH、外加蛋白酶的種類及添加量、自溶時(shí)間，以酵母抽提物的上清氨基態(tài)氮含量、得率及感官評(píng)定作為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行研究和分析，并設(shè)計(jì)五因素四水平的正交實(shí)驗(yàn)分析確定最佳提取參數(shù)，選用L16(45)正交實(shí)驗(yàn)表(見表1)。

表1 酵母自溶條件優(yōu)化的因素和水平Table 1 Factor and levels of orthogonal test of autolysis conditions

1．2．3 測(cè)定方法 氨基酸態(tài)氮(free amino acid nitrogen，F(xiàn)AN)、固形物(不溶物)含量的測(cè)定:參照《GB/T 23530-2009酵母抽提物》中的檢測(cè)方法進(jìn)行測(cè)定［5］。得率公式［6］如下:

得率(%)=上清總重×上清液固形物-外加物質(zhì)干重/自溶前酵母干重×100

感官鑒定:由10人對(duì)酵母抽提物的風(fēng)味進(jìn)行感官評(píng)定，對(duì)其風(fēng)味強(qiáng)弱(濃、中、淡)情況、香氣情況(醬香、不良?xì)馕兜惹闆r)進(jìn)行文字描述，見表2，綜合分析10人的描述，作為其感官鑒定的結(jié)果［7］。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)用SPSS16．0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高壓均質(zhì)對(duì)酵母自溶的影響

高壓均質(zhì)對(duì)于酵母細(xì)胞壁有很好的破壁作用，可破壞酵母細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生紊亂，加速酵母的自溶，并且與酶法處理相比，高壓均質(zhì)更適合于工業(yè)化生產(chǎn)［8］。

2．1．1 均質(zhì)壓力對(duì)酵母自溶的影響 均質(zhì)壓力對(duì)酵母自溶的影響結(jié)果見圖1。從圖1看來，當(dāng)均質(zhì)壓力為0～75MPa時(shí)，氨基態(tài)氮和得率隨均質(zhì)壓力提高呈現(xiàn)逐漸遞增，當(dāng)均質(zhì)壓力超過75MPa后，上清液氨基氮總量幾乎不再增加，75MPa下均質(zhì)的得率與100MPa的差別不大。

圖1 均質(zhì)壓力對(duì)酵母自溶的影響Fig．1 Effect of homogeneous pressure on yeast autolysis

2．1．2 均質(zhì)次數(shù)對(duì)酵母自溶的影響 從圖2可以看出，隨著均質(zhì)次數(shù)的增加，特別均質(zhì)2次和3次，其得率及上清液氨基氮總量較均質(zhì)1次有大幅度的提高，而均質(zhì)2次與均質(zhì)3次相比，均質(zhì)3次的得率及上清液氨基氮總量不再顯著上升。因此，均質(zhì)2次即可得到最大得率及上清液氨基氮總量。

圖2 均質(zhì)次數(shù)對(duì)酵母自溶的影響Fig．2 Effect of homogeneous number on yeast autolysis

2.2 溫度對(duì)酵母自溶的影響

由圖3可知，溫度對(duì)酵母自溶的影響較大，在溫度為55℃時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量及得率均達(dá)到最大值，因此選擇55℃為最佳自溶溫度。這與大部分酵母自溶溫度相一致，這可能是酵母自溶過程中起主要作用的內(nèi)源蛋白酶的最適作用溫度基本在45～60℃左右［9］。

圖3 溫度對(duì)酵母自溶的影響Fig．3 Effect of temperature on yeast autolysis

2.3 pH對(duì)酵母自溶的影響

由圖4可知，當(dāng)pH為6．0時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量及得率均達(dá)到最大值，分別為581mg/100mL和39．7%，故選定酵母自溶的最適pH為6．0。

圖4 pH對(duì)酵母自溶的影響Fig．4 Effect of pH on yeast autolysis

2.4 添加蛋白酶對(duì)酵母自溶的影響

2．4．1 蛋白酶的篩選 對(duì)適合酵母抽提物的蛋白酶篩選結(jié)果見表3。由表3可知，添加蛋白酶都能提高氨基酸態(tài)氮含量與得率，其中添加酸性蛋白酶的氨基態(tài)氮含量最高，比對(duì)照提高7．4%;添加復(fù)合風(fēng)味酶的得率最高，比對(duì)照提高16．7%。同時(shí)經(jīng)過感官評(píng)定，添加風(fēng)味酶的產(chǎn)品風(fēng)味最為濃郁，并且具有醬香和酯香。因此綜合評(píng)價(jià)，在酵母自溶過程中選擇添加復(fù)合風(fēng)味酶。

2．4．2 風(fēng)味酶添加量的確定 結(jié)果見表4所示，風(fēng)味酶添加量為1．0%時(shí)，得率達(dá)到最大，氨基態(tài)氮含量與添加量為1．5%時(shí)的氨基態(tài)氮含量相近，繼續(xù)增大加酶量，得率反而有所降低，推測(cè)原因可能是酶量的增大導(dǎo)致酵母前期水解速度加快，溶液pH下降較快，從而降低了酵母內(nèi)源酶的活性［6］。同時(shí)，添加量為1．5%的樣品風(fēng)味非常濃郁，且?guī)в嗅u香和酯香，故選定風(fēng)味酶的添加量為1．5%。

2.5 時(shí)間對(duì)酵母自溶的影響

隨著時(shí)間的延長，氨基酸態(tài)氮含量、得率和風(fēng)味都逐步提升，當(dāng)24h之后增長幅度明顯減緩，在48h時(shí)氨基態(tài)氮含量最高，風(fēng)味濃郁;當(dāng)進(jìn)行到48h之后雖然得率仍在上升，但氨基態(tài)氮含量開始下降，同時(shí)出現(xiàn)了不良風(fēng)味(見表5)?？赡茉蚴墙湍讣?xì)胞中一些脫羧或脫氨酶，進(jìn)一步將氨基酸分解成了小分子物質(zhì)，導(dǎo)致氨基態(tài)氮含量下降，并產(chǎn)生一些不良風(fēng)味［7］。通過對(duì)抽提液的氨基態(tài)氮、得率及感官評(píng)定等因素的綜合考慮，自溶時(shí)間控制在48h為最佳。

2.6 酵母自溶條件的優(yōu)化

設(shè)計(jì)5因素4水平的正交實(shí)驗(yàn)，以得率作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果的衡量指標(biāo)，通過極差分析及方差分析優(yōu)化酵母自溶的最佳條件，結(jié)果見表6和表7。

由表7可知，根據(jù)方差分析得出結(jié)論為均質(zhì)壓力、溫度、pH、添加風(fēng)味酶和時(shí)間5個(gè)因素的各水平間均有差別。其中，pH和溫度因素對(duì)酵母抽提物得率的影響極顯著(p＜0．01)，均質(zhì)壓力和風(fēng)味酶因素對(duì)酵母抽提物得率的影響顯著(p＜0．05)，時(shí)間因素對(duì)酵母抽提物得率的影響不顯著。并且各因素對(duì)抽提物得率的影響順序是pH＞溫度＞風(fēng)味酶＞均質(zhì)壓力＞時(shí)間。同時(shí)由極差分析結(jié)果可知酵母抽提物得率最高的條件為:均質(zhì)壓力75MPa、溫度50℃、pH6．5、風(fēng)味酶 1．5% 及自溶時(shí)間 48h。

表3 添加蛋白酶對(duì)酵母自溶的影響Table 3 Effect of addition of proteases on yeast autolysis

表4 不同添加量風(fēng)味酶對(duì)酵母自溶的影響Table 4 Effect of different addition amount of flavourzyme on yeast autolysis

表5 時(shí)間對(duì)酵母自溶的影響Table 5 Effect of different time on yeast autolysis

表6 酵母自溶條件優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表L16(45)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6 Orthogonal design and results L16(45)

表7 得率的方差分析Table 7 Variance analysis of yield of yeast extract

按照以上優(yōu)化后的最佳自溶條件，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)三次，均獲得50．1%以上酵母抽提物得率，并且氨基態(tài)氮含量可達(dá)650．6mg/100mL。同時(shí)對(duì)其進(jìn)行感官評(píng)定，酵母抽提物外觀呈紅褐色，有醬香并略帶酯香，口感濃郁有鮮甜味。

3 結(jié)論

本研究以產(chǎn)朊假絲酵母為原料制備酵母抽提物，確定的酵母自溶最佳工藝條件為:以15%濃度的酵母懸浮液，75MPa壓力下循環(huán)均質(zhì)2次后，調(diào)初始pH6．5，并添加 1．5%(w/w)的風(fēng)味酶，溫度 50℃下水浴自溶48h，所得酵母抽提物的氨基態(tài)氮含量為650．6mg/100mL，抽提物得率為 50．1%，該酵母抽提物有醬香并略帶酯香，口感濃郁有鮮甜味。

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