鄭林青，郝少東，張志勇，王進忠，楊寶東，張民照

(農(nóng)業(yè)應用新技術(shù)北京市重點實驗室，北京農(nóng)學院植物科學技術(shù)學院，北京 102206)

小菜蛾P(guān)lutella xylostella L.是世界性十字花科植物害蟲，該蟲發(fā)生代數(shù)多、繁殖速度快、世代重疊嚴重，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中重點的防治對象。長久以來，人們主要以施用殺蟲劑作為對菜蛾的防治手段，但隨著殺蟲劑廣泛、大量的使用，加上菜蛾生活史的特殊性，目前菜蛾幾乎對所有現(xiàn)行殺蟲劑都已產(chǎn)生了較高抗藥性(馮夏等，2011;劉霞和牛芳，2013)。靶標不敏感是昆蟲對殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性的一個極為重要的生化機制(李顯春和王蔭長，1998)。交替使用不同靶標的農(nóng)藥是克服菜蛾抗藥性的重要途徑(趙懷玲和尤民生，2001;黃劍和吳文君，2003)。因此，篩選開發(fā)具有不同作用機制的新型殺蟲劑對于長遠地解決菜蛾抗藥性問題具有重要意義。

斑蝥素(Cantharidin)是一種廣泛存在于鞘翅目芫菁科等昆蟲(俗稱斑蝥Mylabris phalterata pallas)體內(nèi)的次生代謝物，具有較高的殺蟲活性和廣泛的殺蟲譜(張志勇等，1996;魏列新等，2007;劉瑞瑞等，2010)，對菜蛾具有觸殺，胃毒作用(張志勇等，1998)。斑蝥素被飼喂菜蛾后，其胃毒作用部位是試蟲中腸，電鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)菜蛾幼蟲中腸組織發(fā)生明顯的病變，杯狀細胞微絨毛脫落、斷裂，細胞膜性結(jié)構(gòu)壞死，線粒體等細胞器結(jié)構(gòu)變性，部分細胞消融(張雅林等，2003)。斑蝥素觸殺菜蛾后，經(jīng)電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，對蟲體壁表皮層的影響不大，其作用部位是皮細胞，皮細胞線粒體內(nèi)嵴會發(fā)生模糊，出現(xiàn)空泡，表現(xiàn)出與胃毒致死的菜蛾中腸細胞類似的超微結(jié)構(gòu)破壞(陳利平等，2011)。以昆蟲細胞為實驗材料進一步研究，斑蝥素可以迅速穿透細胞膜進入細胞中(汪麗等，2013)，抑制細胞增殖(周晗穎等，2012)。受試細胞出現(xiàn)胞質(zhì)固縮、胞膜突出、質(zhì)膜膜泡化、DNA 片段化、凋亡小體產(chǎn)生等細胞凋亡的顯著特征，證明斑蝥素導致細胞產(chǎn)生的一系列變化系誘導細胞凋亡所致(陳利平等，2008;張來喜等，2011)。顯然，斑蝥素對昆蟲具有與現(xiàn)行農(nóng)藥不同的致毒機理。

斑蝥素的主要靶標為一系列的磷酸蛋白磷酸磷酸酶(Phosphoprotein phosphatase，PPP)(Honkanen，1993;Hastie et al.，1998;Prickett et al.，2006;Swingle et al.，2007)，其中蛋白磷酸酶2A(Protein phosphatase 2A，PP2A)廣泛參與細胞代謝，DNA 的復制、轉(zhuǎn)錄，RNA 的剪切、翻譯，細胞分化，以及細胞凋亡等過程(Janssens et al.，2001;Lechward et al.，2001;Xu et al.，2006)，在PPP 中的含量最高(Cohen，1997)，其基因表達受到嚴格的調(diào)控(Baharians et al.，1998)。PP2A 全酶由一個二聚體的核心酶和一個可變化的調(diào)節(jié)亞基B 組成，核心酶又包括催化亞基C 和結(jié)構(gòu)亞基A(Hemmings et al.，1990)。菜蛾作為重要的農(nóng)業(yè)害蟲，建立其斑蝥素靶標受體PP2A 催化亞基(PP2Ac)基因的表達系統(tǒng)，可為進一步研究其PP2A 的生理功能、結(jié)構(gòu)特點、與斑蝥素的結(jié)合作用原理以及斑蝥素類活性物質(zhì)防治鱗翅目害蟲的改良應用提供重要基礎和科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試昆蟲菜蛾P(guān)lutella xylostella(L)由本實驗室長期人工于25±3℃，相對濕度60%-70%的條件下飼養(yǎng)的敏感種群。

RNeasy Plus Mini Kit、QIAquick Gel Extraction Kit 為QIAGEN 公司產(chǎn)品。rTaq DNA 聚合酶、T4連接酶、限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ與 BamH Ⅰ、2000 bp DNA Marker、1 kb DNA Ladder、蛋白質(zhì)分子量標準(低)、pMD18T-simple 載體、均為TAKARA 公司產(chǎn)品。M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶為Promega公司產(chǎn)品。質(zhì)粒提取試劑盒為北京天根生化公司產(chǎn)品。宿主菌大腸桿菌DH5α 為北京全式金公司產(chǎn)品。細菌蛋白抽提試劑盒、Ni-Agarose His 標簽蛋白純化試劑盒、抗His 標簽鼠單克隆抗體、Goat Anti-Mouse IgG HRP 抗體、DAB 顯色試劑盒為北京康為世紀有限公司產(chǎn)品。蛋白預染Marker 為北京博爾優(yōu)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。pET-30a 質(zhì)粒、宿主菌大腸桿菌BL21(DE3)均為本實驗室保存。其他所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 引物設計

根據(jù) GenBank 收錄的菜蛾 PP2Ac 基因(GenBank 登錄號:KC558556)的ORF 區(qū)，利用Primer 5.0 軟件設計加入HindⅢ與BamHⅠ酶切位點的引物Px-PP2Ac-Hind Ⅲ、Px-PP2Ac-BamH Ⅰ(表1)。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3 總RNA 提取與第一鏈cDNA 合成

將4 齡菜蛾幼蟲用液氮研磨后，參照RNeasy Plus Mini Kit 試劑盒說明書的步驟提取總RNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性及核酸微量檢測儀測定濃度后，使用反轉(zhuǎn)錄酶 M-MLV Reverse Transcriptase、引物Oligo(dT)18 合成cDNA 第一鏈。

1.4 PCR 擴增目的片段

以菜蛾cDNA 為模板，以Px-PP2Ac-Hind Ⅲ、Px-PP2Ac-BamHⅠ為引物進行擴增，PCR 反應條件:95℃預變性5 min;94℃30 s，54℃30s，72℃1 min，35個循環(huán);72℃10 min。反應結(jié)束后使用l%瓊脂糖凝膠電泳檢測并使用QIAquick Gel Extraction Kit 對目的片段進行回收，將回收產(chǎn)物按照pMD18T-simple 載體說明進行連接，之后轉(zhuǎn)入DH5α 內(nèi)，藍白班篩選后挑取單克隆菌落培養(yǎng)，經(jīng)PCR 鑒定后的陽性菌液送至北京中科希林生物技術(shù)公司測序。

1.5 pET30a-PP2Ac 原核表達載體的構(gòu)建

將含有目的基因的T 載體和原核表達載體pET-30a 的質(zhì)粒分別用Hind Ⅲ和BamH I 進行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)l%瓊脂糖凝膠電泳檢測和膠純化后使用T4 連接酶進行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α，卡那霉素(50μg/mL)抗性平板篩選?？剐跃涞馁|(zhì)粒經(jīng)測序驗證后命名為pET30a-PXPP2Ac。提取重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，經(jīng)卡那霉素抗性平板篩選后，保存抗性菌落用于重組蛋白的表達。

1.6 重組PP2Ac 蛋白表達條件的優(yōu)化及分析

為了獲得大量的重組蛋白，通過對誘導劑IPTG的濃度及誘導溫度的調(diào)整，篩選最佳的表達條件。

1.6.1 IPTG 誘導濃度的優(yōu)化取過夜培養(yǎng)的含重組質(zhì)粒的菌液，按1∶50稀釋到含卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，37℃，180 rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0.5 時，分別加入終濃度為0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6 mM 的IPTG，在25℃下誘導培養(yǎng)，4 h 后經(jīng)10000 g 離心5 min收集菌體，使用無菌水重懸后按比例加入SDS 上樣緩沖液，100℃煮沸5 min，12%SDS-PAGE 電泳分析重組蛋白的表達情況。

1.6.2 不同溫度對重組蛋白表達量及表達形式的影響取過夜培養(yǎng)的含重組質(zhì)粒的菌液，按1∶50稀釋到含卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，37℃，180 rpm 振蕩培養(yǎng)至OD600在0.5 左右，加入上一步優(yōu)化確定的 IPTG 至終濃度，18℃、25℃、30℃、35℃下，180 rpm 繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后收集菌體，使用12%SDS-PAGE 電泳分析誘導溫度對重組蛋白表達的影響。按照細菌蛋白抽提試劑盒說明，對不同溫度下誘導的含重組蛋白的菌液進行裂解，分別取上清和沉淀進行12%SDS-PAGE 電泳，分析不同溫度下重組蛋白的表達形式。

1.7 PP2Ac 包涵體蛋白的純化

根據(jù)優(yōu)化的表達條件，選擇使用IPTG 濃度0.2 mM、溫度30℃的條件大量誘導表達PP2Ac，取誘導后的菌液及未經(jīng)誘導的菌液進行12% SDSPAGE 電泳，使用電轉(zhuǎn)印法在100 V 電壓下轉(zhuǎn)印1 h至PVDF 膜(0.45μm)上，加入抗His 標簽鼠單克隆抗體(1∶3500 稀釋)，4℃過夜，再加入Goat Anti-Mouse IgG HRP 抗體(1∶2000 稀釋)，取出膜后進行DAB 顯色對表達產(chǎn)物進行檢驗。

表達產(chǎn)物經(jīng)4℃、12000 r/min 離心10 min 收集，按照Ni-Agarose His 標簽蛋白純化試劑盒說明書進行包涵體蛋白的純化，經(jīng)SDS-PAGE 檢測純化的重組蛋白。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的克隆

以菜蛾cDNA 為模板，對PP2Ac 基因進行擴增的產(chǎn)物，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示(圖1)有一條大小約為940 bp 的條帶，與預期結(jié)果相符。

圖1 PCR 擴增PP2Ac 基因Fig.1 PP2Ac gene amplified by PCR

2.2 菜蛾原核表達載體的構(gòu)建

小菜蛾P(guān)P2Ac 基因的PCR 產(chǎn)物與表達載體pET30a 的質(zhì)粒DNA，分別使用限制性內(nèi)切酶HindⅢ與BamHⅠ雙酶切后進行連接和轉(zhuǎn)化。經(jīng)藍白班篩選，挑取陽性單克隆并進行PCR 鑒定(圖2)，確定轉(zhuǎn)化成功后提取重組質(zhì)粒，使用Hind Ⅲ與BamHⅠ進行雙酶切鑒定，得到5.4 Kb 的載體片段以及相應大小為941bp 的目的片段(圖3)，說明原核表達載體構(gòu)建成功，命名為pET30a-PX-PP2Ac。

圖2 重組質(zhì)粒PCR 鑒定Fig.2 PCR verify the recombinant plasmid

圖3 Hind Ⅲ與BamHⅠ雙酶切鑒定Fig.3 Used restrict enzyme Hind Ⅲand BamH I to verify the recombinant plasmid

2.3 重組蛋白表達條件的優(yōu)化

2.3.1 不同IPTG 濃度對誘導表達的影響

由SDS-PAGE 電泳結(jié)果顯示(圖4)，在全菌液中重組蛋白表達量隨著IPTG 濃度的提高而增加，但是非目的蛋白的表達量也有所增加，在使用終濃度為0.2 mM 的IPTG 誘導時，非目的蛋白存在較少同時可大量表達目的蛋白，因此確定該濃度為表達重組蛋白的最佳濃度。

圖4 25℃下不同IPTG 濃度下誘導pET30a-PX-PP2Ac 蛋白表達Fig.4 Different concentration of IPTG induced pET30a-PX-PP2Ac protein expression under 25°C

2.3.2 不同溫度對重組蛋白表達量及表達形式的影響

在菌液中加入終濃度為0.2 mM 的IPTG，以溫度為18、25、30、35℃的條件下對菌液進行誘導表達，由圖5 可見，目的蛋白的表達量濃度隨著溫度的升高而增加。但是，圖6 顯示在不同溫度誘導的菌體的裂解液中，目的蛋白均以包涵體形式存在于沉淀中，菌體裂解液的上清中沒有可溶性蛋白。

圖5 0.2 mM IPTG 誘導，不同溫度下pET30a-PX-PP2Ac 的蛋白表達Fig.5 0.2 mM concentration of IPTG induced pET30a-PX-PP2Ac protein expression under different temperature

圖6 不同溫度下pET30a-PX-PP2Ac 重組蛋白的表達形式Fig.6 Existence form of the pET30a-PXPP2Ac protein expression under different temperature

2.4 重組蛋白的純化

經(jīng)Western Blot 對誘導產(chǎn)物進行檢測后可見(圖7)，誘導的菌液在35-40 KDa 間出現(xiàn)一條與目的蛋白大小相符的條帶，這說明菌液中的蛋白與抗His 標簽的抗體間具有良好的特異性反應，而未經(jīng)誘導的菌液沒有條帶的產(chǎn)生，結(jié)果顯示誘導表達的產(chǎn)物是具有His 標簽的目的蛋白。

圖7 Western blot 分析PP2Ac 蛋白Fig.7 Western blot analysis of thePP2Ac protein

目的蛋白經(jīng)純化后，通過12%SDS-PAGE 檢測，結(jié)果顯示(圖8)，使用300 mM 咪唑洗脫液對結(jié)合了目的蛋白的鎳柱進行洗脫，在第2、3 mL洗脫液中出現(xiàn)了大小約38 KD 目的蛋白，由于目的蛋白周圍無雜帶，可以將其分離后進行后續(xù)的相關(guān)研究使用。

圖8 pET30a-PX-PP2Ac 表達蛋白的純化Fig.8 Purify the pET30a-PX-PP2Ac protein of expression

3 結(jié)論與討論

大腸桿菌表達系統(tǒng)是基因工程中常用的表達工具，但是在表達外源基因的過程當中，常會遇到表達效率不高、產(chǎn)率較低、蛋白表達無活性等問題。誘導條件的改變對于目的蛋白的表達具有一定的影響。有報道稱，較低濃度的IPTG 即可誘導外源蛋白的大量表達(張嘉萱等，2011)。本試驗結(jié)果顯示IPTG 濃度為0.2 mM 時即可誘導pET30a-PX-PP2Ac 的大量表達，隨著IPTG 濃度的增加，重組蛋白的表達量并無明顯提高，但非目的蛋白的表達量有所增加，所以選用終濃度為0.2 mM 的IPTG 誘導該蛋白的表達。降低誘導溫度可以增加重組蛋白的可溶性表達和表達產(chǎn)物的活性，使包涵體的比例下降(宛傳丹等，2004;李琳，2010)。在本試驗中分別在18、25、30、35℃對重組蛋白進行誘導表達，將菌體裂解后分析蛋白的表達形式，結(jié)果表明重組蛋白均存在于沉淀中，以包涵體的形式存在，由此可見菜蛾P(guān)P2Ac 在原核表達中受誘導條件改變的影響不大，較難產(chǎn)生可溶性蛋白。為了解決這一問題，可考慮選用其他表達系統(tǒng)，對目的蛋白進行表達(吳丹等，2002)。

目前，斑蝥素作為殺蟲劑已經(jīng)開發(fā)應用(張雅林等，2006)，并且在我國已被作為農(nóng)藥產(chǎn)品投放市場，也明確了斑蝥素與有關(guān)殺蟲劑混用的增效作用(刁紹東等，2003;魏列新等，2007;鄭勝禮等，2007)。但是，斑蝥素對昆蟲的毒殺機理及作用機制尚不完全明確。本試驗選取IPTG 終濃度0.2 mM、溫度30℃為表達條件大量表達目的蛋白后，經(jīng)純化后得到了可分離的包涵體蛋白。此蛋白的獲得為研究PP2A 蛋白結(jié)構(gòu)奠定了基礎，一方面有利于明確斑蝥素與PP2Ac 間的結(jié)合作用，豐富對斑蝥素殺蟲作用機理的了解;另一方面，可從菜蛾P(guān)P2A 的蛋白結(jié)構(gòu)入手，比較昆蟲與哺乳動物間的差異，并以此為基礎對斑蝥素及其類似物農(nóng)藥在化學結(jié)構(gòu)上進行修飾，從而提高對靶標生物的藥效。同時，利用純化的蛋白作為抗原制備單克隆抗體對昆蟲體內(nèi)的PP2A 蛋白分布進行免疫檢測，可以掌握受體蛋白在蟲體的分布，對斑蝥素類農(nóng)藥的劑型改良及施用方式等具有一定的指導意義。此外，還可將單抗固定在惰性固相基質(zhì)上制成層析柱(王莉等，2007)，使PP2A 蛋白質(zhì)與單抗特異性結(jié)合，對PP2A 蛋白質(zhì)進行分離純化，從而高效、大量的獲得目的蛋白，為進一步明確斑蝥素及其類似物在殺蟲過程中與靶標受體PP2A 的作用過程提供基礎。

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