夏 嬙，孫虹霞，劉宏宇

(1.遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)/貴州省免疫學(xué)研究生教育創(chuàng)新基地，珠海 519041;2.中山大學(xué)有害生物控制與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510275)

昆蟲雖然缺乏獲得性免疫系統(tǒng)，不能合成脊椎動(dòng)物的免疫球蛋白(Lavine and Strand，2002)，但這種相對(duì)簡(jiǎn)單的免疫系統(tǒng)可使其成為環(huán)境污染的有效指示生物(Galloway and Depledge，2001)。隨著重金屬污染的日益嚴(yán)重，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外關(guān)于重金屬污染對(duì)昆蟲免疫反應(yīng)影響得到極大關(guān)注。如Cd2+脅迫48-72 h 使棕尾別麻蠅Boettcherisca peregrina 幼蟲血細(xì)胞包囊作用顯著低于對(duì)照，Cd2+處理濃度達(dá)到150μg/g 時(shí)蛹的包囊率與對(duì)照相比顯著降低(李艷敏等，2010);而Ni 濃度達(dá)50μg/g 時(shí)即可使大蠟螟Galleria mellonella 產(chǎn)生顯著的免疫應(yīng)答，并顯著抑制其酚氧化酶的活性(Dubovskiy et al.，2011);重金屬脅迫亦可使木蟻Formica aquilonia 及秋尺蠖Epirrita autumnata 產(chǎn)生免疫反應(yīng)(Sorvari et al.，2007;van Ooik et al.，2007)。重金屬對(duì)昆蟲免疫反應(yīng)影響與重金屬的特性、脅迫時(shí)間、生物體的發(fā)育程度、基因型、性別及所選用的免疫參數(shù)有關(guān)(van Ooik et al.，2007)。包囊反應(yīng)作為昆蟲免疫反應(yīng)的一個(gè)重要指標(biāo)，在昆蟲免疫學(xué)研究中被廣泛應(yīng)用。

由于工業(yè)生產(chǎn)中鎳(Ni)的不合理排放、污水灌溉及含Ni 肥料的過量施用，越來(lái)越多的Ni 及其化合物進(jìn)入農(nóng)業(yè)土壤(羅丹等，2010;Amin et al.，2013)，造成土壤Ni 含量的超標(biāo)(Cai et al.，2010;Li et al.，2012)。據(jù)廣東省生態(tài)環(huán)境與土壤研究所2005年的報(bào)道，Ni 是珠江三角洲近40%農(nóng)田土壤重金屬污染的第二大污染物，其超標(biāo)值最高可達(dá)59.3%。土壤中過量的Ni2+可在蔬菜中積累，對(duì)蔬菜產(chǎn)生毒害作用(Garrido et al.，2005)，從而對(duì)植食性昆蟲產(chǎn)生影響。

斜紋夜蛾Spodoptera litura Fabricius 是農(nóng)田重要的植食性害蟲，對(duì)多種作物尤其是蔬菜產(chǎn)生嚴(yán)重危害。前期研究表明，飼料中Ni2+可在斜紋夜蛾幼蟲體內(nèi)積累(孫虹霞等，2008)，并對(duì)其血淋巴中能源物質(zhì)(孫虹霞等，2010)、生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響(Sun et al.，2007)。根據(jù)能量代謝、生長(zhǎng)發(fā)育和免疫反應(yīng)之間的“trade-off”原則，幼蟲體內(nèi)積累的Ni2+是否會(huì)對(duì)斜紋夜蛾幼蟲的免疫應(yīng)答產(chǎn)生影響?基于此，本文研究了斜紋夜蛾5、6 齡幼蟲血細(xì)胞對(duì)凝膠珠的包囊率在120 h 內(nèi)的變化情況，為研究重金屬Ni 對(duì)斜紋夜蛾免疫功能的影響提供理論依據(jù)，并為全面研究Ni 脅迫對(duì)斜紋夜蛾的影響提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 斜紋夜蛾幼蟲的飼養(yǎng)與Ni2+脅迫

斜紋夜蛾系中山大學(xué)昆蟲學(xué)研究所養(yǎng)蟲室提供，飼養(yǎng)條件為(26±1)℃，L∶D=16∶8，RH(75±5)%。在人工飼料中添加不同劑量Ni2+，并以此連續(xù)3 代飼喂斜紋夜蛾幼蟲。以第1 代幼蟲化蛹后羽化成蟲所產(chǎn)的卵作為第2 代蟲源，第3 代依此類推，每天更換飼料并連續(xù)脅迫3 代。

根據(jù)Cai 等(2010)的報(bào)道，珠三角地區(qū)如東莞農(nóng)業(yè)土壤Ni 含量范圍為2.29-57.46 mg/kg，Macnicol and Beckett(1985)及 Garridoe 等(2005)的研究表明蔬菜中Ni 含量可達(dá)30 mg/kg;而斜紋夜蛾寄主之一Raphanus sativus L.中積累的Ni 含量在3.28-66.67 mg/kg 之間(Xu et al.，2008)。此外，我們的預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)飼料中的Ni2+濃度高于50 mg/kg 時(shí)，第4 代成蟲所產(chǎn)卵的孵化率極低。因此，根據(jù)上述研究基礎(chǔ)，通過在人工飼料中添加不同濃度的NiCl26H2O，使飼料中Ni2+終濃度分別為1 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg 和40 mg/kg。以不添加Ni2+飼料飼養(yǎng)的斜紋夜蛾幼蟲為對(duì)照(記為0 mg/kg)。

1.2 包囊反應(yīng)的檢測(cè)

1.2.1 Sephadex G-25 葡聚糖凝膠珠的注射

Sephadex G-25 葡聚糖凝膠珠購(gòu)于Pharmacia公司。芐基青霉素和鏈霉素購(gòu)于Amersco 公司。參照文獻(xiàn)Richardsand Parkinson(2000)方法，用0.1%的堿性品紅將Sephadex G-25 葡聚糖凝膠珠染色過夜并置于紫外燈下自然晾干。使用時(shí)將凝膠珠溶于Pringle's 生理鹽水中(芐基青霉素和鏈霉素的終濃度分別為1000 U/mL 和1 mg/mL)。

待幼蟲進(jìn)入5 齡后，每隔24 h 隨機(jī)挑選各個(gè)處理長(zhǎng)勢(shì)均一的10 頭幼蟲進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，直至幼蟲發(fā)育至6 齡末，分別記為0-24 h、24-48 h、48-72 h、72-96 h 及96-120 h 幼蟲。注射前將幼蟲冰上麻醉，然后用酒精棉球消毒蟲體。微量毛細(xì)管從第三腹足將凝膠珠注射入蟲體內(nèi)。0-24 h 幼蟲約注射20-25個(gè)凝膠珠，隨著蟲體的增大，注射的凝膠珠數(shù)目也逐漸增加，每次約增加8-12個(gè)凝膠珠，以保證不同發(fā)育期蟲體包囊作用的穩(wěn)定性。注射24 h 后解剖蟲體，相差顯微鏡(Carl Zeiss)下觀察凝膠珠的包囊情況。

1.2.2 包囊程度的分級(jí)

根據(jù)包囊的厚度對(duì)血細(xì)胞的包囊程度進(jìn)行劃分，每一類分別用漸次增加的數(shù)字表示。0 級(jí):沒有血細(xì)胞黏附或只有數(shù)個(gè)血細(xì)胞黏附;1 級(jí):包囊厚度小于凝膠珠半徑的1/2;2 級(jí):包囊厚度大于凝膠珠半徑的1/2，小于半徑;3 級(jí):包囊厚度大于凝膠珠半徑。根據(jù)凝膠珠被包囊的面積對(duì)血細(xì)胞的包囊程度進(jìn)行劃分，每一類也分別用漸次增加的數(shù)字表示。0 級(jí):沒有血細(xì)胞黏附或只有數(shù)個(gè)血細(xì)胞黏附;1 級(jí):包囊面積小于凝膠珠表面的1/2;2 級(jí):包囊面積大于凝膠珠表面的1/2(Hu et al.，2003)。

每一時(shí)間點(diǎn)的包囊率為被包囊凝膠珠數(shù)占總凝膠珠數(shù)的比例。將2種分級(jí)方法中包囊類別均大于或等于2 的凝膠珠計(jì)為已包囊，其它的計(jì)為未包囊。

1.3 數(shù)據(jù)分析

不同發(fā)育階段的5、6 齡幼蟲血細(xì)胞對(duì)凝膠珠的包囊率經(jīng)arcsin 轉(zhuǎn)換后，進(jìn)行ANOVA 單因素方差分析，若差異顯著再經(jīng)post hoc 多重分析(SAS8.1)，以闡明各處理間差異的顯著性。同時(shí)，采用了兩因素方差分析的PROC GLM 檢驗(yàn)飼料中Ni2+劑量和脅迫世代數(shù)雙因素對(duì)血細(xì)胞包囊率的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 斜紋夜蛾幼蟲血細(xì)胞對(duì)Sephadex G-25 凝膠珠的包囊反應(yīng)

不同Ni2+脅迫下斜紋夜蛾幼蟲血細(xì)胞對(duì)Sephadex G-25 凝膠珠的包囊情況見圖1。圖1 中A、B 為0 級(jí);C、D 為1 級(jí);E、F 為2 級(jí);G、H為3 級(jí)。

圖1 斜紋夜蛾幼蟲血細(xì)胞對(duì)Sephadex G-25 凝膠珠的包囊反應(yīng)Fig.1 Encapsulation hemocytes of Sephadex G-25 beads in Spodoptera litura larvae.

2.2 Ni2+ 脅迫對(duì)斜紋夜蛾幼蟲血細(xì)胞包囊率的影響

2.2.1 Ni2+脅迫對(duì)0-24 h 幼蟲血細(xì)胞包囊率的影響

連續(xù)3 代0-24 h 幼蟲血細(xì)胞對(duì)凝膠珠包囊率均在1 mg/kg 和5 mg/kg 脅迫濃度下高于對(duì)照(除1 mg/kg Ni2+脅迫下第2 代幼蟲外，均顯著高于對(duì)照);10 mg/kg 和20 mg/kg Ni2+脅迫的第2、3 代幼蟲血細(xì)胞的包囊率均低于對(duì)照，但僅第3 代幼蟲血細(xì)胞對(duì)凝膠珠的包囊率顯著低于對(duì)照;40 mg/kg Ni2+脅迫下血細(xì)胞對(duì)凝膠珠的包囊率在各個(gè)世代均低于對(duì)照(圖2)。說明此濃度已對(duì)斜紋夜蛾幼蟲血細(xì)胞的免疫功能產(chǎn)生影響。

圖2 取食含不同劑量Ni2+人工飼料的斜紋夜蛾0-24 h 幼蟲血細(xì)胞的包囊率Fig.2 Encapsulation rate of hemocytes at the period of 0-24 h from the beginning of the 5th instar Spodoptera litura larvae exposed to different nickel doses for 3 generations

2.2.2 Ni2+脅迫對(duì)24-48 h 幼蟲血細(xì)胞包囊率的影響

24-48 h 幼蟲血細(xì)胞對(duì)凝膠珠的包囊率與0-24 h 的變化規(guī)律類似，但各處理幼蟲與對(duì)照的差異性有所不同。經(jīng)過連續(xù)3 代1 mg/kg 及5 mg/kg Ni2+脅迫幼蟲血細(xì)胞的包囊率均顯著高于對(duì)照，而在20 mg/kg 及以上處理濃度Ni2+脅迫的第2、3 代幼蟲血細(xì)胞的包囊率則顯著低于對(duì)照(圖3)。這表明隨脅迫時(shí)間增加，Ni2+對(duì)幼蟲免疫抑制作用增強(qiáng)。

圖3 取食含不同劑量Ni2+人工飼料的斜紋夜蛾24-48 h 幼蟲血細(xì)胞的包囊率Fig.3 Encapsulation rate of hemocytes at the period of 24-48 h from the beginning of the 5th instar Spodoptera litura larvae exposed to different nickel doses for 3 generations

2.2.3 Ni2+脅迫對(duì)48-72 h 幼蟲血細(xì)胞包囊率的影響

在48-72 h 內(nèi)，第1、2、3 代1 mg/kg 和5 mg/kgNi2+脅迫下幼蟲血細(xì)胞的包囊率均高于對(duì)照，第1、3 代在此處理濃度下包囊率與對(duì)照相比顯著增加;20 mg/kg 以上Ni2+脅迫下連續(xù)3 代幼蟲的包囊率均顯著低于對(duì)照及5 mg/kg 以下Ni2+脅迫幼蟲血細(xì)胞的包囊率(圖4)。

圖4 取食含不同劑量Ni2+人工飼料的斜紋夜蛾48-72 h 幼蟲血細(xì)胞的包囊率Fig.4 Encapsulation rate of hemocytes at the period of 48-72 h from the beginning of the 5th instar Spodoptera litura larvae exposed to different nickel doses for 3 generations

2.2.4 Ni2+脅迫對(duì)72-96 h 幼蟲血細(xì)胞包囊率的影響

72-96 h 時(shí)間段內(nèi)1 mg/kg Ni2+脅迫下3個(gè)世代幼蟲血細(xì)胞的包囊率與對(duì)照相比均增加，且第1、3 代顯著增加;5 mg/kg 及以上Ni2+脅迫的第2、3代幼蟲血細(xì)胞的包囊率均顯著低于對(duì)照(圖5)。

圖5 取食含不同劑量Ni2+人工飼料的斜紋夜蛾72-96 h 幼蟲血細(xì)胞的包囊率Fig.5 Encapsulation rate of hemocytes at the period of 72-96 h from the beginning of the 5th instar Spodoptera litura larvae exposed to different nickel doses for 3 generations

2.2.5 Ni2+脅迫對(duì)96-120h 幼蟲血細(xì)胞包囊率的影響

在96-120 h 時(shí)間段內(nèi)，第1 代幼蟲血細(xì)胞的包囊率在1 mg/kg 及5 mg/kg 處理濃度下升高，處理濃度達(dá)到10 mg/kg 及以上時(shí)包囊率下降;第2、3 代各處理幼蟲血細(xì)胞對(duì)凝膠珠的包囊率均顯著低于對(duì)照，并隨脅迫濃度的增加呈遞減趨勢(shì)，存在一定的劑量反應(yīng)關(guān)系(圖6)。這可能是隨脅迫時(shí)間增加，Ni2+對(duì)斜紋夜蛾幼蟲的免疫損壞程度增加，導(dǎo)致其免疫應(yīng)答減弱。

圖6 取食含不同劑量Ni2+飼料的斜紋夜蛾96-120 h 幼蟲血細(xì)胞的包囊率Fig.6 Encapsulation rate of hemocytes at the period of 96-120 h from the beginning of the 5th instar Spodoptera litura larvae exposed to different nickel doses for 3 generations

2.2.6 Ni2+劑量和脅迫世代數(shù)對(duì)幼蟲血細(xì)胞包囊率的交互影響

不同時(shí)間段幼蟲對(duì)凝膠珠包囊率的兩因素方差分析結(jié)果如表1 所示。結(jié)果表明，飼料中不同劑量的Ni2+與脅迫世代數(shù)對(duì)不同時(shí)間段幼蟲的包囊率均產(chǎn)生顯著影響。但是，飼料中不同Ni2+劑量以及脅迫世代數(shù)兩因素未對(duì)24-48 h 以及48-72 h 幼蟲的包囊率產(chǎn)生顯著的交互影響，這說明幼蟲包囊的形成是與脅迫時(shí)間長(zhǎng)短及脅迫劑量雙因素密切相關(guān)的。

表1 飼料中Ni2+劑量和脅迫世代數(shù)對(duì)斜紋夜蛾5 齡幼蟲120 h 內(nèi)包囊率交互影響的顯著性檢驗(yàn)P 值Table 1 P-values of effects of nickel doses in diet and stressing generations on encapsulation rate of the 5th instar larvae of Spodoptera litura exposed to different doses of nickel for 120 h

3 結(jié)論與討論

昆蟲通過包囊反應(yīng)來(lái)清除血腔內(nèi)的寄生蜂和外源寄生物，因此，包囊反應(yīng)多與昆蟲的免疫反應(yīng)呈正相關(guān)性(Dubovskiy et al.，2011)。本研究結(jié)果顯示，飼料中Ni2+的短期脅迫對(duì)斜紋夜蛾幼蟲包囊反應(yīng)的影響主要表現(xiàn)在低劑量(1 mg/kg、5 mg/kg)Ni2+促進(jìn)而高劑量(40 mg/kg)Ni2+抑制的現(xiàn)象，這與Sorvari 等(2007)研究木蟻F.aquilonia 的免疫反應(yīng)相類似，木蟻對(duì)重金屬脅迫的免疫反應(yīng)也存在低濃度促進(jìn)而高濃度抑制的現(xiàn)象;而E.Autumnata 及G.mellonella 的免疫反應(yīng)則隨重金屬處理濃度增加而增加(van Ooik et al.，2007;Dubovskiy et al.，2011)。

Ni2+對(duì)斜紋夜蛾幼蟲免疫反應(yīng)的影響與飼料中Ni2+的劑量、脅迫時(shí)間及幼蟲的發(fā)育階段相關(guān)聯(lián)。對(duì)5 齡初幼蟲而言，幼蟲攝入的Ni2+含量較低，對(duì)體內(nèi)Ni2+含量增加的敏感性較強(qiáng)，可迅速增加血細(xì)胞對(duì)凝膠珠的包囊率，以抵御過量Ni2+的危害;而隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)Ni2+的免疫毒性增強(qiáng)，血細(xì)胞的包囊形成能力降低。

第1 代各發(fā)育階段幼蟲及第2、3 代0-96 h幼蟲的包囊反應(yīng)均存在低劑量Ni2+脅迫下促進(jìn)而高劑量脅迫下抑制的現(xiàn)象，但李艷梅等(2010)研究結(jié)果則表明，Cd2+脅迫導(dǎo)致棕尾別麻蠅幼蟲血細(xì)胞包囊反應(yīng)在48-72 h 內(nèi)下降，96 h 后作用不明顯。這可能是不同種類昆蟲對(duì)不同重金屬的脅迫表現(xiàn)出不同的免疫應(yīng)答。我們?cè)谘芯恐羞€發(fā)現(xiàn)，斜紋夜蛾幼蟲血細(xì)胞的凋亡在高劑量Ni2+的長(zhǎng)期脅迫下也受到抑制(Sun et al.，2011)。因此，我們推測(cè)Ni2+脅迫對(duì)血細(xì)胞功能的影響可能是包囊反應(yīng)受到影響的原因之一。

本文研究表明，5 mg/kg 及以下處理濃度Ni2+的1 代脅迫可提高0-120 h 幼蟲血細(xì)胞對(duì)凝膠珠的包囊反應(yīng)，但2-3 代的脅迫只增加發(fā)育初期0-72 h 幼蟲血細(xì)胞的包囊反應(yīng);10-20 mg/kg 處理濃度Ni2+的1 代脅迫僅增加0-24 h 幼蟲血細(xì)胞的包囊率，但可降低2-3 代幼蟲血細(xì)胞各發(fā)育時(shí)間的包囊率;40 mg/kg Ni2+脅迫可降低連續(xù)3個(gè)世代各個(gè)發(fā)育階段幼蟲血細(xì)胞的包囊率;飼料中Ni2+劑量、脅迫世代數(shù)以及兩者的交互作用均對(duì)幼蟲血細(xì)胞的包囊率產(chǎn)生了顯著影響。

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