王 萍，胥 冰，張麗君(陜西中醫(yī)學(xué)院免疫教研室，咸陽 712046;通訊作者，E-mail:smilewangping@163.com)

丙型肝炎是一種由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染機(jī)體后所引起的傳染性疾病，全世界約2億人為HCV感染者，且其中80%感染者為慢性持續(xù)感染者，慢性丙型肝炎是引起肝硬化、原發(fā)性肝癌重要原因之一。研究證實調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)具有免疫無能和免疫抑制兩大功能，在誘導(dǎo)和維持免疫耐受過程中發(fā)揮重要作用［1，2］。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn) Treg 細(xì)胞在 HBV、HCV、HIV等病毒感染性疾病中發(fā)揮一定作用［3］。為進(jìn)一步研究Treg細(xì)胞在慢性丙型肝炎中的作用，本研究擬通過對慢性丙型肝炎患者外周血CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞、核轉(zhuǎn)錄因子Foxp3及轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)的檢測，初步探討Treg細(xì)胞在慢性丙型肝炎中的變化及其意義。

1 資料和方法

1.1 研究對象

選擇2012-06～2013-03在陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院住院和門診治療的慢性丙型肝炎患者60例，其中男性36例，女性24例，年齡20-63歲，平均年齡(37.19±14.07)歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2000年中華醫(yī)學(xué)會傳染病與寄生蟲學(xué)分會、肝病學(xué)分會聯(lián)合修訂的《病毒性肝炎防治方案》［4］，排除標(biāo)準(zhǔn):排除甲、乙、丁、戊型肝炎及其他病毒性疾病、自身免疫性、惡性腫瘤、藥物及酒精性肝炎及嚴(yán)重心腎內(nèi)分泌疾病等。同期在陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院進(jìn)行體檢的40例健康體檢者作為正常對照組，其中男性22例，女性18 例，年齡18-60 歲，平均年齡(35.67 ±12.39)歲，均排除病毒性疾病、自身免疫性疾病、腫瘤和藥物及酒精性肝炎。兩組研究對象在性別(χ2=0.246，P=0.619)、年齡(t=0.554，P=0.580)上的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

1.2 方法

1.2.1 CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞，利用人淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個核細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/ml。500 μl單細(xì)胞懸液加入 20 μl FITCCD4抗體，混勻后避光孵育20 min;洗滌離心后分別加入4℃ 1×固定液、37℃ 1×破膜液后洗滌重懸細(xì)胞后，加入20 μl PE-Foxp3或同型對照抗體，孵育30 min后洗滌重懸細(xì)胞。應(yīng)用FACS Calibur型流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，通過Cellquest軟件進(jìn)行收集分析數(shù)據(jù)。

1.2.2 Foxp3 mRNA表達(dá)水平檢測 采用實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測Foxp3 mRNA表達(dá)水平，取 500 μl單細(xì)胞懸液，加入 1.0 ml TRIzol液提取外周血單個核細(xì)胞總RNA，利用cDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行第一鏈合成，以上操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。根據(jù)文獻(xiàn)合成 Foxp3及內(nèi)參GAPDH 引物［5］，20 μl PCR 反應(yīng)體系如下:SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(2 × )10 μl、PCR 上下游引物(2 μmol/L)各 2 μl、cDNA 6 μl。擴(kuò)增條件為:95 ℃ 10 s預(yù)變性，95 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，共45個循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束采用2-ΔΔCt分析Foxp3 mRNA基因的相對表達(dá)。

1.2.3 血漿中TGF-β1水平檢測 無菌采集靜脈血2.0 ml，1 500 r/min 離心 10 min 分離血漿，采用酶聯(lián)免疫試吸附試劑盒檢測血漿中TGF-β1水平，每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 慢性丙型肝炎患者外周血CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞百分率變化

流式細(xì)胞分析(以CD4+細(xì)胞為門)結(jié)果顯示慢性丙型肝炎患者外周血CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞百分率與正常對照組相比明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05，見圖 1、表1)。

圖1 慢性丙型肝炎患者外周血CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞百分率變化Figure 1 The changes of CD4+Foxp3+Treg cells in the peripheral blood of patients with chronic hepatitis C by flow cytometry

2.2 慢性丙型肝炎患者外周血Foxp3 mRNA表達(dá)水平變化

熒光定量PCR檢測Foxp3 mRNA表達(dá)水平結(jié)果顯示:與正常對照組相比，慢性丙型肝炎患者外周血Foxp3 mRNA表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05，見表1)。

2.3 慢性丙型肝炎患者血漿中TGF-β1濃度變化

慢性丙型肝炎患者血漿TGF-β1水平明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，見表1)。

表1 兩組研究對象外周血中CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞、Foxp3 mRNA、TGF-β1水平的比較Table 1 Com parison of the levels of CD4+Foxp3+Treg cells，F(xiàn)oxp3 mRNA and TGF-β1 in the peripheral b lood of patients with chronic hepatitis C between two groups

3 討論

HCV 感染機(jī)體后可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，但體液免疫不能有效地清除病毒。隨著對丙型肝炎發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入，目前普遍認(rèn)為丙型肝炎病毒造成的肝臟損傷及轉(zhuǎn)歸與機(jī)體細(xì)胞免疫功能及免疫耐受密切相關(guān)。機(jī)體免疫功能異常，不能清除HCV，導(dǎo)致病毒長期存在形成慢性感染。研究證實慢性丙型肝炎患者體內(nèi)HCV特異的CD8+和CD4+T細(xì)胞反應(yīng)活性降低，國內(nèi)外研究顯示調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在慢性丙型肝炎的進(jìn)展中起到重要的作用［6-10］。

自從1995年日本學(xué)者 Sakaguchi等［11］發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞以來，隨著研究深入認(rèn)為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是一群獨立的細(xì)胞，Treg細(xì)胞在自身免疫性疾病、腫瘤、移植及感染性疾病中發(fā)揮重要作用［1，2］。最近研究證實Treg細(xì)胞在HCV感染中也發(fā)揮一定作用［6-10］，但研究結(jié)果并不完全一致，可能與每個研究的病例選擇、采樣時間、Treg細(xì)胞檢測分選手段不同等因素有關(guān)。目前普遍認(rèn)為Foxp3是Treg細(xì)胞分化過程中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄激活因子［12］，因此我們利用CD4+Foxp3+作為檢測Treg細(xì)胞的標(biāo)記。而Treg細(xì)胞主要通過分泌 TGF-β1來發(fā)揮作用效應(yīng)［2］，我們同時檢測了HCV患者血漿中TGF-β1的水平。實驗結(jié)果顯示慢性丙型肝炎患者CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞百分率、Foxp3 mRNA及血漿TGF-β1水平與正常對照組相比均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，這與國內(nèi)外的研究結(jié)果基本一致［5-9］。研究證實Treg細(xì)胞具有免疫抑制性和免疫無能性功能，其發(fā)揮抑制作用的靶細(xì)胞不區(qū)分CD4+和CD8+T細(xì)胞。在慢性丙型肝炎患者體內(nèi)CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞增多，抑制了HCV特異性CD8+T細(xì)胞功能，不能完全清除HCV，使病毒長期存在，造成慢性感染。

綜上所述，慢性丙型肝炎患者體內(nèi) CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞及血漿TGF-β1水平增高，發(fā)揮了免疫抑制作用，減弱HCV特異性CD8+T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，病毒無法清除，造成 HCV慢性感染。但CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞發(fā)揮抑制作用的信號分子及信號傳遞通路尚未完全清楚，深入研究 CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞與慢性丙型肝炎的關(guān)系，可能為闡明丙型肝炎的慢性化機(jī)制及指導(dǎo)其治療提供理論及實驗基礎(chǔ)。

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