劉金娜，劉銘，楊太新，賈東升，溫春秀，謝曉亮，*，田偉，劉玲娣

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河北保定071000；2.河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，河北石家莊050051）

栝樓系葫蘆科（Cucurbitaceae）植物，其入藥部位較多，《中國(guó)藥典》已將栝樓Trichosanthes kirilowii Maxim.和雙邊栝樓Trichosanthes rosthornii Harms的種子、果實(shí)、果皮及根分別藥用，習(xí)稱(chēng)瓜蔞子、全瓜蔞、瓜蔞皮及天花粉[1]。栝樓富含油脂類(lèi)、甾醇類(lèi)、三萜類(lèi)、黃酮苷類(lèi)及蛋白質(zhì)等多種化學(xué)成分，具有改善心血管系統(tǒng)功能、祛痰止咳、抗菌、抗?jié)儭⒖鼓[瘤及瀉下等生物活性[2]。藥理實(shí)驗(yàn)又表明發(fā)揮化痰止咳作用的物質(zhì)與其所含的半胱氨酸、天門(mén)冬氨酸和蛋氨酸有關(guān)，蛋白質(zhì)作為生命活動(dòng)的體現(xiàn)者，轉(zhuǎn)化成小分子氨基酸才能被動(dòng)植物所利用，因而蛋白的含量在一定程度上可反映氨基酸來(lái)源的多少。因此有必要對(duì)栝樓各藥用部位的蛋白含量進(jìn)行測(cè)定分析。

近年來(lái)栝樓的研究多側(cè)重在各入藥部位具體化學(xué)成分的比較分析上，瓜蔞子中3，29-二苯甲酰基栝樓仁三醇、α-菠菜甾醇含量的比較分析及瓜蔞籽油脂特性的分析[3-5]；瓜蔞皮中揮發(fā)性成分、有機(jī)酸的測(cè)定及葉黃素提取工藝的研究[6]；天花粉中葫蘆素B的提取及含量測(cè)定等方面多見(jiàn)報(bào)道[7]，有關(guān)粗蛋白在栝樓各藥用部位的分布情況及不同種之間的含量比較上報(bào)道甚少。

本試驗(yàn)將搜集到的13個(gè)不同居群的栝樓資源集中種植統(tǒng)一管理，除了環(huán)境因子的影響，在同一水平上分別對(duì)不同居群的瓜蔞子、瓜蔞皮及天花粉中蛋白的含量進(jìn)行了測(cè)定，探明了粗蛋白在栝樓各藥用部位的分布情況，明確了以粗蛋白為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的最優(yōu)栝樓種質(zhì)，為合理開(kāi)發(fā)利用栝樓資源及品種選育提供參考。

1 材料

1.1 試劑

硫酸銨；Brij- 3530%溶液；硫酸鉀；氫氧化鈉；磷酸氫二鈉；次氯酸鈉；硝普鈉；酒石酸鉀鈉；水楊酸鈉；蒸餾水。

1.2 儀器與材料

AA3型流動(dòng)分析儀：荷蘭SKALAR公司；AX504分析天平：瑞士梅特勒公司；TDL80-2B離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

本實(shí)驗(yàn)所用瓜蔞子、瓜蔞皮及天花粉均由河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所提供。

2 方法

2.1 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法

2.1.1 溶液的制備

緩沖液的配置：取磷酸氫二鈉35.8 g、氫氧化鈉32 g和酒石酸鉀鈉50 g精密稱(chēng)定，分別加入重蒸水溶解，后稀釋定容至 1000 mL?；旌暇鶆蚝笤偌尤? mL Brij- 3530%溶液。

水楊酸鈉溶液的配制：取水楊酸鈉40 g，精密稱(chēng)定，溶于600 mL蒸餾水中，加入1 g硝普鈉，稀釋定容止至 1000 mL。溶液混均備用。

次氯酸鈉溶液的配制：加入3 mL次氯酸鈉溶液至60 mL水中。再稀釋至100 mL，混合均勻備用。

進(jìn)樣器清洗液的配制：加入40 mL硫酸至600 mL水中，待冷卻后稀釋定容至 1000 mL。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備

取4.717 g硫酸銨精密稱(chēng)定，加蒸餾水溶解稀釋至1L制成標(biāo)準(zhǔn)液A備用，量取上述標(biāo)準(zhǔn)液A5mL，加蒸餾水稀釋至100mL，配置成每升含氮50mg的標(biāo)準(zhǔn)液B。

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)液 B 0、5、7.5、10、12.5、15、20、30 mL，分別置于50 mL容量瓶中，660 nm下采用流動(dòng)分析儀進(jìn)行分析測(cè)定。以峰高A為縱坐標(biāo)，氨氮的濃度c為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。所得線(xiàn)性方程為：A=0. 9897c+0. 0672，R2=0. 9986，結(jié)果表明氨氮濃度在0～30 mg/L范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.2 供試品溶液的制備

取藥材粉末（過(guò)40目篩子）約0.2 g，精密稱(chēng)定，置于消煮管中，向其中加入8 mL的濃硫酸，320℃下消煮至溶液變?yōu)槌吻?，其間每隔30 min加入適量雙氧水。待消煮液冷卻至室溫時(shí)，向其中依次加入適量的蒸餾水，搖勻靜置，冷卻后過(guò)濾，再加水稀釋至50 mL容量瓶?jī)?nèi)，備用。

2.3 蛋白含量的測(cè)定

采用濃硫酸-雙氧水消煮法，將植物體內(nèi)各種形態(tài)的氮轉(zhuǎn)化成銨態(tài)氮進(jìn)入無(wú)機(jī)相，硝普鈉用做催化劑，與水楊酸鈉及次氯酸鈉發(fā)生反應(yīng)生成一種藍(lán)色化合物，可在660 nm處測(cè)定。

精密量取上述供試品溶液0.5 mL，加水稀釋10倍，采用流動(dòng)分析法和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法，660 nm下比色分析，測(cè)得吸光值A(chǔ)，根據(jù)2.1.2項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備計(jì)算其蛋白含量。

2.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0，組間比較采用t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 不同居群栝樓間各藥用部位蛋白的含量

不同居群栝樓間各藥用部位蛋白的含量，見(jiàn)表1。

表1可見(jiàn)，不同種質(zhì)栝樓間各藥用部位蛋白含量具有一定的差異性，籽中蛋白含量最高的種質(zhì)來(lái)源于河南安陽(yáng)文峰區(qū)，其含量最高可達(dá)（69.758±0. 0327）mg/g，果皮中蛋白含量最高屬山西侯馬為（93.443±0. 0398）mg/g，根中蛋白含量最高達(dá)（51.076±0. 0550）mg/g來(lái)自于河北安國(guó)。

表1 不同居群栝樓各藥用部位蛋白含量（mg/g，n=3）Table 1 Medicinal parts of protein content in different group of Trichosanthes kirilowii

3.2 不同地域栝樓間各藥用部位蛋白含量的比較分析

不同地域栝樓間各藥用部位蛋白含量的比較分析，見(jiàn)表2。

表2 不同地域栝樓間各藥用部位蛋白含量比較分析（mg/g，n=3）Table 2 Medicinal parts of protein content in different area of Trichosanthes kirilowii

將同一省份內(nèi)的不同栝樓居群各入藥部位的蛋白含量進(jìn)行合并，由表2知，不同省份栝樓中蛋白含量差異顯著，其中山西、河南地區(qū)蛋白含量差異不明顯，但與其他3省差異達(dá)顯著水平，安徽地區(qū)蛋白含量最低；瓜蔞子、瓜蔞皮及天花粉不同地域之間蛋白含量亦差異顯著，其中河南地區(qū)瓜蔞子中蛋白的含量最高且顯著高于其他四省，山東、河北、山西地區(qū)瓜蔞子中蛋白的含量差異不明顯；山西地區(qū)瓜蔞皮中蛋白含量最高，其次為河南、山東、河北，安徽地區(qū)蛋白含量最低；河北地區(qū)天花粉中蛋白達(dá)到最大值，顯著高于山東、安徽、山西、河南四省。

3.3 各藥用部位蛋白含量的比較分析

栝樓各藥用部位蛋白含量均差異顯著，其中來(lái)自河北、山東、安徽的栝樓資源，其種子中蛋白含量顯著高于皮和根；山西、河南的栝樓種質(zhì)，其皮部蛋白最高，其次為子，根部最低，見(jiàn)圖1。

圖1 栝樓各藥用部位蛋白含量的比較Fig.1 Comparation of protein content in different medicinal parts of Trichosanthes kirilowii

4 結(jié)論與討論

連續(xù)流動(dòng)分析儀是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種分析技術(shù)，可將繁瑣的手工比色付諸于自動(dòng)的儀器操作，并能使所有的樣品在同等的條件下發(fā)生反應(yīng)，再通過(guò)檢測(cè)器將信號(hào)傳入電腦進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，同時(shí)減小了手工操作和條件差異產(chǎn)生的誤差，具有靈敏、快速高效、省時(shí)省力省試劑、污染小等優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測(cè)、醫(yī)藥、化工分析等領(lǐng)域。本試驗(yàn)采用了該方法對(duì)河北、山東、安徽、河南、山西5省共13份栝樓資源各藥用部位中的蛋白含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明不同藥用部位蛋白含量差異顯著，不同地域之間其蛋白含量亦差異顯著，其中河南安陽(yáng)一帶的栝樓種質(zhì)其種子中蛋白含量最高為（69.758±0. 0327）mg/g，以蛋白含量為考評(píng)指標(biāo)，供藥食兩用具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，山西侯馬一帶的瓜蔞皮中的蛋白含量最高為（93.443±0. 0398）mg/g，河北安國(guó)一帶的天花粉中蛋白含量最高為（51.076±0. 0550）mg/g，因此根據(jù)市場(chǎng)需求及收獲目的的不同，可選擇最優(yōu)的種質(zhì)資源田間栽培以期獲得較高的經(jīng)濟(jì)效益。

整體分析可知，山西、河南一帶的栝樓資源引種于河北石家莊，其總蛋白含量較安徽高，山東居中，這可能與南北氣候差異較大有關(guān)，一般相同緯度下引種較容易，然而山西侯馬、絳縣、新絳以及河南安陽(yáng)，其緯度與石家莊最為接近，受環(huán)境影響較小，加之河南安陽(yáng)一帶是全國(guó)栝樓的主產(chǎn)區(qū)之一，栝樓種質(zhì)較優(yōu)，其含量相對(duì)較高，安徽隸屬南方，南北氣候差異較大，引種不易，其蛋白含量較低在很大程度上與不適應(yīng)的氣候有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)的材料均播種在同一生長(zhǎng)環(huán)境下，同樣的栽培條件其蛋白含量亦差異顯著，多年種植后，這種差異會(huì)趨于一致但仍存在一定的差異性。環(huán)境在一定程度上會(huì)影響植物體內(nèi)物質(zhì)組成的改變，但不能起到?jīng)Q定性的作用，基因型的改變才會(huì)引起質(zhì)的變化。優(yōu)質(zhì)的中藥材不僅產(chǎn)量要高，其能發(fā)揮藥效的物質(zhì)的含量也應(yīng)該較高。然而通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法獲得的中藥種質(zhì)，雖然產(chǎn)量增加了但是發(fā)揮藥效的物質(zhì)的含量并沒(méi)有增加，可能還有減少的趨勢(shì)，甚者還會(huì)產(chǎn)生未知的新物質(zhì)，影響藥材的配伍及藥效的發(fā)揮，具有一定的風(fēng)險(xiǎn)性，因此藥材優(yōu)質(zhì)種質(zhì)的選育宜從栽培條件的優(yōu)化和常規(guī)育種方法著手。優(yōu)質(zhì)的藥材種質(zhì)種植在不適宜生長(zhǎng)的環(huán)境下，其發(fā)揮藥效成分的物質(zhì)會(huì)慢慢減少，甚者長(zhǎng)時(shí)間種植會(huì)不及普通的種質(zhì)資源，而普通的種質(zhì)種植在最適宜的環(huán)境下，其藥效含量會(huì)有上升的趨勢(shì)，然而優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)在其最適宜的環(huán)境下生長(zhǎng)所收獲的藥材，其質(zhì)優(yōu)，穩(wěn)定，療效可靠，可以稱(chēng)之為道地藥材。因此對(duì)中藥材道地性的研究宜為中藥材優(yōu)質(zhì)種質(zhì)選育的手段之一，必要時(shí)結(jié)合常規(guī)雜交育種方式，以期為中藥優(yōu)質(zhì)種質(zhì)選育提供新思路。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010：104

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