楊萬根，謝瓊，朱秋勁，顧仁勇，黃群，余佶

1(吉首大學(xué)食品科學(xué)研究所，湖南吉首，416000)2(貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽，550025)

乾州板鴨是湘西吉首地區(qū)具有濃郁地方特色的傳統(tǒng)肉制品，制作的歷史可以追溯到清末時(shí)期。乾州板鴨以湘西麻鴨為原料，用肉桂、丁香、川椒、山奈、八角、白胡椒等上等香料制成的混合鹽香料進(jìn)行腌制。制作精良的乾州板鴨呈琵琶形，色澤金黃，油光發(fā)亮，肉質(zhì)細(xì)嫩，味香可口，風(fēng)味獨(dú)特。

乾州板鴨要經(jīng)過長達(dá)20余天的腌制和15d風(fēng)干過程才能形成其獨(dú)特的風(fēng)味。在此過程中，由于內(nèi)源酶作用和微生物的作用，板鴨中會(huì)發(fā)生各種生化反應(yīng)，其中包括蛋白質(zhì)的降解作用，形成氨基酸、肽類、有機(jī)酸等小分子物質(zhì)［1］。目前，國內(nèi)對(duì)南京板鴨研究較多［2-3］，但由于2種板鴨的制作工藝不同，因此乾州板鴨的蛋白質(zhì)降解規(guī)律會(huì)與之存在差異。本研究以不同加工階段的乾州板鴨樣品為研究對(duì)象，通過SDS-PAGE電泳和掃描電鏡觀察蛋白質(zhì)的降解及肌肉纖維的變化情況。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

乾州板鴨，麻鴨，購于乾州農(nóng)貿(mào)市場，宰殺去毛，去除內(nèi)臟，洗凈，用香料腌制，出缸風(fēng)干;小分子標(biāo)準(zhǔn)樣品、牛血清蛋白、丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、TEMED、β-巰基乙醇，Sigma 公司;SDS、NaH2PO4、Na2HPO4、KI、迭氮鈉、甘油、溴酚藍(lán)、甲醇、冰醋酸、Tris堿、過硫酸銨、HCl、甘氨酸、戊二醛、乙醇、CuSO4、酒石酸鉀鈉、NaOH、磺基水楊酸、KOH，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

EPS-300電泳儀、VE-180垂直電泳槽，上海天能科技有限公司;FD5-2.5冷凍干燥機(jī)，Sim International Group;722可見分光光度計(jì)、JA2003電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;PHSJ-4A pH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司;FHS-2高速勻漿機(jī)，金壇市億通電子有限公司;HH-S2恒溫水浴鍋，金壇市成輝儀器廠;TG165醫(yī)用離心機(jī)，長沙平凡儀器儀表有限公司;THZ-82A水浴恒溫振蕩器，金壇市順華儀器有限公司;FESEM JEOL 6700F掃描電子顯微鏡(SEM)，日本電子有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 全肌肉蛋白的提取

采用Bechtel［4］的方法，將 4 g鴨胸肉剪碎，加入10 mL 提取液(2%SDS，10mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4，pH 7.0)，然后勻漿 30 s，離心(1 500 × g，15 min)，所得上清液即是全肌肉蛋白溶液。

1.2.2 肌漿蛋白的提取

采用 Bechtel［4］的方法，稱取 2 g 剪碎肉樣，加入20 mL 0.02 mol/L pH 6.5 的磷酸鹽緩沖液(PBS)，使用高速分散器在6 000 r/min下勻漿3min，在離心力10 000×g及4℃下離心20 min，所得上清液即為肌漿蛋白。

1.2.3 肌原纖維蛋白的提取

采用Bechtel［4］的方法，上述離心沉淀重新懸浮于0.03 mol/L pH 6.5的PBS溶液中，在高速分散器中勻漿(6 000 r/min，4 min)，然后離心(10 000 × g，4℃，20 min)，去除上清液，重復(fù)以上操作3次，除去肌肉中的內(nèi)源蛋白酶，最終沉淀再次懸浮于8 mL 0.1 mol/L pH 6.5的PBS中，另加入KI和迭氮鈉使最終濃度分別為0.7 mol/L和0.02%，懸浮液在高速分散器中勻漿(7 000 r/min，3 min)，然后離心(10 000×g，4℃，20 min)，吸取上清即為肌原纖維蛋白。

1.2.4 蛋白質(zhì)濃度測定

用雙縮脲法［5］測定蛋白質(zhì)濃度，標(biāo)準(zhǔn)蛋白為牛血清蛋白。

1.2.5 SDS-PAGE 電泳方法

采用Laemimli［6］不連續(xù)SDS-PAGE 電泳系統(tǒng)，并參照汪家政等［7］和郭堯君［8］的方法。分離膠濃度為14%，濃縮膠濃度為4%。

1.2.6 肌纖維的SEM測定

將樣品細(xì)切成(0.3 ×1.0 ×1.0)cm 肉片，在2.5%戊二醛中于4℃下固定3 d，然后用體積分?jǐn)?shù)30%、50%、70%、90%、100%的乙醇溶液逐級(jí)脫水(每級(jí)脫水30 min)，再浸在乙酸異戊酯中置換30 min。完成置換的樣品凍干，粘臺(tái)，噴金，SEM觀察、拍照。

2 結(jié)果與討論

2.1 全肌肉蛋白的SDS-PAGE電泳

全肌肉蛋白由10%的結(jié)締組織蛋白、30%的肌漿蛋白和60%的肌原纖維蛋白構(gòu)成。由圖1可知，在板鴨的加工過程中，第7天樣品的電泳圖與原料肉相似，說明全肌肉蛋白降解不明顯，但到了第14天，39 kDa條帶明顯消失，22 kDa條帶明顯變?nèi)?，說明全肌肉蛋白在此時(shí)有了明顯的降解。腌制第21天、風(fēng)干第7天和第14天產(chǎn)品與腌制第14天產(chǎn)品相比，蛋白質(zhì)條帶分布變化不大，但12 kDa處條帶隨加工時(shí)間延長顏色變深，說明小分子質(zhì)量多肽增加。

全肌肉蛋白發(fā)生降解，既可能是由內(nèi)源蛋白酶作用，也可能是因微生物生長而分泌的外源蛋白酶作用。但從圖1看，39 kDa條帶和22 kDa條帶在4℃條件下腌制第14天時(shí)即有了較明顯的降解，因此微生物產(chǎn)生蛋白酶分解的可能性不大。因此推測，在乾州板鴨加工中所發(fā)生的肌肉蛋白質(zhì)降解主要是內(nèi)源蛋白酶的作用。據(jù)報(bào)道，肌肉中起到降解蛋白質(zhì)作用的內(nèi)源蛋白酶主要是組織蛋白酶和鈣激活蛋白酶［9-10］。組織蛋白酶來源于肌細(xì)胞漿中的溶酶體，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)近20種組織蛋白酶，其中的組織蛋白酶B、D、H和L在動(dòng)物屠宰后的肌肉蛋白質(zhì)降解中發(fā)揮關(guān)鍵的作用［11］。鈣激活蛋白酶則在肉的成熟和嫩化作用中居于中心地位［12］。但研究發(fā)現(xiàn)，鈣激活中性蛋白酶具有自溶作用，隨著腌制時(shí)間的延長，肉中鈣激活蛋白酶的活力逐漸下降，最后幾乎能完全失去活性［13］。Rosell等報(bào)道，火腿中鈣激活酶降解蛋白質(zhì)的作用僅發(fā)生在腌制的最初2周內(nèi)［14］。而組織蛋白酶在肉制品腌制過程中都有活性，例如在干腌火腿加工結(jié)束時(shí)仍保持約5%的活性［15］。因此，在腌制第21天前，由于組織蛋白酶和鈣激活蛋白酶的共同作用，蛋白質(zhì)較快的降解，但之后鈣激活蛋白酶活力減弱甚至消失，組織蛋白酶引起的蛋白質(zhì)組分變化較小，導(dǎo)致圖1中腌制第21天后的樣品之間蛋白質(zhì)組分分子量差異不大。

圖1 板鴨加工過程中全肌肉蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.1 SDS-PAGE of muscle protein during dry-salted duck processing

2.2 肌漿蛋白的SDS-PAGE電泳

圖2 板鴨加工過程中胸肉肌漿蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.2 SDS-PAGE of breast sarcolasmic protein during dry-salted duck processing

從圖2看出，在板鴨加工各階段中，原料樣的39 kDa處條帶在腌制第7天時(shí)已經(jīng)變?nèi)?，在腌制?4天時(shí)消失，這與全肌肉蛋白前14 d變化規(guī)律一致，說明全肌肉蛋白39 kDa處的條帶變化是來源于肌漿蛋白的變化。15 kDa處條帶隨加工的進(jìn)程逐漸加深，到風(fēng)干第14天時(shí)，形成了明顯的條帶，14 kDa處條帶也逐漸加深，說明板鴨在腌制過程中蛋白質(zhì)不斷發(fā)生降解，形成的多肽數(shù)量增多。

2.3 肌原纖維蛋白的SDS-PAGE電泳

肌原纖維蛋白由肌動(dòng)蛋白、肌動(dòng)球蛋白和肌球蛋白等組成，對(duì)肉制品的凝膠特性有重要影響［16］。

圖3 板鴨加工過程中胸肉肌漿蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.3 SDS-PAGE of breast myofibrilar protein during dry-salted duck processing

如圖3所示，在板鴨的加工過程中，肌原蛋白的61 kDa條帶和43 kDa條帶在板鴨的加工過程中逐漸增強(qiáng)，可能是加工過程中大分子條帶發(fā)生降解而成;而21 kDa條帶逐漸消失，則是這部分蛋白發(fā)生了水解。從腌制21天到風(fēng)干第14天，條帶變化不大，說明肌原纖維蛋白在這段時(shí)間內(nèi)降解不明顯。

2.4 肌肉纖維的SEM結(jié)果

乾州板鴨加工過程中肌肉纖維的變化如圖4所示。原料肉的肌纖維排列有規(guī)律、緊密，是完整的肌纖維，凍干后肌纖維間空隙很小。腌制14 d后，肌纖維的排列開始變得松散，凍干的樣品肌肉間空隙增大，但還呈較完整的肌纖維。風(fēng)干7 d后，完整的肌纖維開始斷裂成幾截。風(fēng)干14 d后，肌纖維斷裂的情況加劇，并且肌纖維的數(shù)量減少，空隙明顯增大。由SDS-PAGE分析結(jié)果可知，在腌制前14 d肌肉蛋白質(zhì)降解比較明顯，在腌制第21天至風(fēng)干第14天，雖然有一定的蛋白質(zhì)降解，但不明顯。因此可知，在腌制前14 d肌肉纖維內(nèi)部發(fā)生了蛋白質(zhì)的降解，但沒有顯現(xiàn)出來，在之后繼續(xù)的降解中，肌纖維結(jié)構(gòu)快速崩解。

圖4 肉樣的電鏡掃描圖(a為放大100倍，b為放大200倍)Fig.4 Scanning electron micrograph of the meat

3 結(jié)論

細(xì)胞中的蛋白質(zhì)降解主要有四條途徑:溶酶體途徑，線粒體蛋白酶系統(tǒng)途徑，泛素-蛋白酶體途徑和胞液蛋白水解途徑［17］。動(dòng)物屠宰后，由于許多內(nèi)源酶如鈣激活酶、組織蛋白酶類的分解作用，肌肉蛋白質(zhì)發(fā)生降解。在乾州板鴨的加工過程中，全肌肉蛋白、肌漿蛋白和肌原纖維蛋白在腌制的前14 d有明顯降解，而從腌制第21天到風(fēng)干第14天，肌肉蛋白降解不明顯。板鴨的肌肉纖維在經(jīng)過腌制和風(fēng)干后，從排列緊密變得松散，從完整的纖維斷裂成幾截，肌纖維的數(shù)量減少，肌纖維間的孔隙增大。

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