李 迅， 鄧若冰， 王 飛*

(1.南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，江蘇南京210037;2.江蘇省生物質(zhì)綠色燃料與化學(xué)品重點(diǎn)實驗室，江蘇南京210037)

隨著傳統(tǒng)化學(xué)合成工藝帶來的負(fù)面影響越來越受到人們重視，人類迫切需要找到綠色工藝來取代現(xiàn)有的工藝，以減少對環(huán)境的破壞.以生物酶類為催化劑的合成工藝可以很好地克服化學(xué)工藝的高能耗及高污染的缺陷，同時還具有選擇性專一等特點(diǎn)，目前已應(yīng)用于有機(jī)合成、手性化合物拆分和醫(yī)藥中間體等領(lǐng)域.脂肪酶(Lipase，EC 3.1.1.3)，也稱羧酸酯酶(carboxylesterases)，它催化長鏈脂酰甘油水解為甘油、游離脂肪酸和單、雙甘油酯［1］.

南極假絲酵母脂肪酶B(CALB)，是一種優(yōu)良的脂肪酶，CALB為催化劑的合成工藝具有低能耗、無污染、轉(zhuǎn)化率高、選擇性專一等優(yōu)點(diǎn)，CALB沒有界面活性［2］，有極強(qiáng)的立體選擇性，且具有廣譜的底物接受性，對非水溶性和水溶性物質(zhì)都有很強(qiáng)的催化活性［3-5］，因此具有很高的潛在工業(yè)價值，廣泛應(yīng)用于有機(jī)合成、手性化合物拆分和醫(yī)藥中間體等領(lǐng)域［6-10］.但商業(yè)化的CALB價格昂貴，如諾維信公司生產(chǎn)的Novozyme 435價格在300元/g左右，限制了其在工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)中的應(yīng)用.目前，CALB基因已成功被克隆，并在米曲霉(Aspergillus oryae)［11］、大腸桿菌(Escherichia coli)［12］、畢赤酵母(Pichia pastoris)［13］、釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)［14］等宿主菌中實現(xiàn)表達(dá)，但 CALB在大腸桿菌中表達(dá)無法正確后修飾，其大多為包涵體［12］，而在釀酒酵母中容易過度糖基化而影響CALB活力［15］.而巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)除了菌體生長速度快，表達(dá)量高，遺傳穩(wěn)定性好，分泌效率高等特點(diǎn)，而且自身分泌的蛋白較少，減少了分離純化的成本［16］，本研究將 CALB基因克隆至載體pPICZ A和pGAPZ A中，轉(zhuǎn)至KM71H中，篩選獲得高效表達(dá)CALB的酵母工程菌株，并對重組酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步分析.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 南極假絲酵母(C.antarctica，NRRL No.Y-7954)來源于美國農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心.大腸桿菌(E.coli)DH5，畢赤酵母(P.pastoris)KM71H和質(zhì)粒pPICZαA和pGAPZαA購自Invitrogen(Carlsbad，California，USA)公司.引物由上海生工生物工程有限公司合成.

1.1.2 試劑與儀器 對硝基苯酚辛酸酯(pNPO，4-nitrophenyl octanoate)，RNase A，氨芐青霉素(Amp)購自Sigma公司;Ex-Taq聚合酶，DNA ATailing試劑盒，限制性內(nèi)切酶等購自TaKaRa公司;PCR純化、低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)和提質(zhì)粒試劑盒購自BIOMIGA公司;Yeast extract，Peptone購自 Oxoid公司.其余生化試劑和藥品均為分析純.

1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基、YPD和YPDS培養(yǎng)基等參考Invitrogen公司的畢赤酵母表達(dá)手冊.

1.2 方法

1.2.1 載體構(gòu)建及酵母電轉(zhuǎn)化 抽提南極假絲酵母的基因組DNA，以此為PCR模板，參照GeneBank上發(fā)表的南極假絲酵母脂肪酶B基因序列(Gene-Bank登錄號:Z30645)設(shè)計兩端特異性引物，上游引物:5'-CCCGAATTCGCCACTCCTTTGGTGAAGC-3’(斜線為EcoRI酶切位點(diǎn));下游引物:5'-CCCGGTACCTCAGGGGGTGACGATGCCGGAGCAG-3’(斜線為KpnI酶切位點(diǎn)).(采用PCR方法擴(kuò)增獲得目的基因calb)PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRI和KpnI雙酶切后連入pPICZαA和pGAPZαA，獲得重組載體 pPICZαA-CALB 和 pGAPZαA-CALB.重組質(zhì)粒經(jīng)Sac I線性化后電激整合入畢赤酵母KM71H細(xì)胞基因組中，涂布含抗生素Zeocin 100 μg/mL的YPDS平板，30℃培養(yǎng)48 h后，挑取單菌落于YPD培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng).

1.2.2 CALB重組工程菌的篩選和表達(dá) 挑取單菌落接種于含體積分?jǐn)?shù)5%三辛酸甘油酯的YNB為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的平板上，30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d以上，并每天補(bǔ)充100 μL甲醇至平板蓋上，觀察并選取水解圈較大的重組子接種于YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用于后續(xù)進(jìn)一步誘導(dǎo)表達(dá).

以pPICZ A為表達(dá)載體的畢赤酵母工程菌表達(dá)過程如下:用滅菌的竹簽挑取單菌落接種于含25 mL BMGY培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，30℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600為2～6，約24 h，嚴(yán)格無菌操作.在8 000 r/min下離心5 min，棄上清，將菌轉(zhuǎn)入新鮮的BMMY培養(yǎng)基中，至OD600約為1.0，嚴(yán)格無菌操作，30℃、200 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)96 h，每24 h添加一次甲醇至終體積分?jǐn)?shù)為0.5%.12 000 r/min離心5 min，發(fā)酵液上清液即為粗酶液.

以pGAPZαA為表達(dá)載體的畢赤酵母工程菌表達(dá)過程如下:挑取鑒定正確的陽性單菌落至含有50 mL YPD液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，在30℃和 250 r/min的條件下振蕩培養(yǎng) 96 h，12 000 r/min離心5 min，發(fā)酵液上清即為粗酶液.

1.2.3 CALB的高密度發(fā)酵 將篩選得到的高產(chǎn)脂肪酶基因工程菌挑取單菌落接種于BMGY培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)，再轉(zhuǎn)接至大瓶BMGY培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并作為發(fā)酵罐種子液.將種子液接種于發(fā)酵罐中，控制溶氧值DO為35%，自動流加氨水維持pH值為8.0，發(fā)酵24 h左右基礎(chǔ)培養(yǎng)基碳源耗盡，DO迅速上升至90%，此時以40%的流速恒速補(bǔ)加甘油，直到工程菌OD600達(dá)到200，停止補(bǔ)加甘油.待甘油停加2 h后，開始進(jìn)入甲醇誘導(dǎo)階段，5 mL/h的速度流加甲醇，每小時以10%遞增速度補(bǔ)加甲醇，直到10 mL/h的速度，維持此流加速度.培養(yǎng)至84 h.

1.2.4 測定方法 以pNPO為底物的分光光度法測定脂肪酶酶活.取100 μL適宜質(zhì)量濃度的酶液(質(zhì)量濃度控制在所測吸光度為0.1～1之間)和850 μL 的0.05 mol/L Tris·HCl(pH7.5)緩沖液混合，空白樣則用緩沖液代替酶液的體積，預(yù)熱5 min，加入50 μL 13.5 mmol/L pNPO 作為底物，在40℃準(zhǔn)確反應(yīng)5 min后，立即加入100 μL異丙醇終止反應(yīng).將反應(yīng)液13 000 r/min離心5 min，取上清，在410 nm處測吸光值.一個酶活單位(U)定義為在pH7.5、40℃條件下，每分鐘釋放1 mol對硝基苯酚(pNP)所需要的酶量.蛋白質(zhì)量濃度的測定方法采用 Bradford 法［17］.

1.3 酶學(xué)性質(zhì)測定

1.3.1 最適溫度和溫度穩(wěn)定性 分別在20、30、40、50、60和70℃下測定pNPO酶活，以確定重組CALB的最適反應(yīng)溫度.將適宜質(zhì)量濃度酶液分別放在30、40、55和60℃下保溫2 h測定 pNPO酶活，依次在 20、40、60、80、100 和120 min 取樣，以確定重組 CALB的溫度穩(wěn)定性.將所取酶樣按照1.2.4方法測定 pNPO酶活，酶活測定條件均為pH8.0和40℃，每個樣品重復(fù)3次.

1.3.2 最適pH值和pH穩(wěn)定性 分別在pH值為5～10的0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液下測定pNPO酶活，以確定CALB的最適反應(yīng)pH值.將酶液分別在不同pH的0.1 mol/L緩沖液(pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5 和 10.0)中 16 ℃條件下放置1 h后，在40℃，pH8.0的條件下按照1.2.4方法測定pNPO酶活，以測定CALB的pH穩(wěn)定性，每個樣品重復(fù)3次.

1.3.3 金屬離子和表面活性劑對重組脂肪酶的影響將酶與不同的金屬離子(Cu2+、Zn2+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Ni+、Ba2+和 Co2+，5 mmol/L;體積分?jǐn)?shù)0.1%SDS和0.05%Triton-X100)混合后常溫放置1 h，然后取樣在pH8.0值為和40℃條件下按照1.2.4方法測定pNPO酶活，對照樣不加添加劑，其他條件相同，每個樣品重復(fù)3次.

2 結(jié)果與分析

2.1 重組載體的構(gòu)建 以南極假絲酵母NRRL Y-7954基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增得到CALB成熟肽編碼序列，PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoR I和Kpn I雙酶切后連入 pPICZ A和 pGAPZ A，獲得重組載體pPICZ A-CALB和pGAPZ A-CALB.重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切(EcoR I和Kpn I)鑒定正確(圖1)后轉(zhuǎn)入畢赤酵母KM71H中表達(dá).

2.2 啟動子對重組CALB表達(dá)的影響 對比不同質(zhì)粒pPICZαA(啟動子為 AOX)和 pGAPZαA(啟動子為GAP)對CALB基因在畢赤酵母中表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，以AOX啟動子型的重組菌較GAP啟動子型的重組菌具有更高的表達(dá)量和酶活，pPICZαA-CALB+KM71H重組菌培養(yǎng)4 d后酶活達(dá)11.11 U/mL，蛋白質(zhì)量濃度為0.45 mg/mL，較原始菌中脂肪酶酶活(2.56 U/mL)高四倍多.而pGAPZαA-CALB+KM71H重組菌培養(yǎng)4 d后酶活僅為0.52 U/mL，蛋白質(zhì)量濃度為0.020 mg/mL因此，選擇AOX啟動子型的重組菌(pPICZαA-CALB+KM71H重組菌)進(jìn)行后續(xù)的研究(見圖2).

2.3 CALB的篩選和高密度發(fā)酵 挑選三丁酸甘油脂平板中有較大水解圈的重組菌，將菌體保存于-80℃含有體積分?jǐn)?shù)15%甘油的YPD管中，并對這些重組菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，測定脂肪酶活力，其中pPICZαA-CALB重組菌產(chǎn)脂肪酶酶活最高為42.90 U/mL，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為0.51 mg/mL，比酶活為83.79 U/mg，較未篩選之前(見2.2)有大幅提高，并且酶活高于相關(guān)文獻(xiàn)報道［15，18］.選擇該菌株進(jìn)行高密度發(fā)酵，培養(yǎng)至84 h，發(fā)酵液酶活可達(dá)179.19 U/mL，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為1.36 mg/mL，SDS-PAGE蛋白電泳分析如圖3，顯示重組蛋白亞基為37 kDa，且目的蛋白的條帶相對單一，可進(jìn)行下一步脂肪酶酶學(xué)定性.

2.4 酶學(xué)性質(zhì)測定

2.4.1 最適溫度和溫度穩(wěn)定性 如圖4(A)所示，CALB在40℃時酶活達(dá)到最大.在30～40℃范圍內(nèi)，保溫60 min，重組CALB酶活都能保持70%以上，在55℃時，CALB酶活降低較快，保溫60 min后殘余CALB酶活為未保溫樣品的48.5%.可認(rèn)為，該酶在在30～55℃范圍內(nèi)，能保持較高的反應(yīng)活性，也有較好的溫度穩(wěn)定性.

2.4.2 最適pH值和pH穩(wěn)定性 如圖5所示，CALB在弱堿環(huán)境具有較好的活性，在pH值為8.0時，活性最高.在酸性條件下，酶活都低于最高酶活的30%.CALB的pH穩(wěn)定性結(jié)果如圖5(B)所示.在pH7.5～9.5之間的緩沖液中處理1 h后仍保持60%以上的水解活力，pH8.5時酶的穩(wěn)定性最大，之后酶的穩(wěn)定性呈下降趨勢.該酶在酸性條件下穩(wěn)定性較差，在pH為6.5以下保溫1 h后基本測不到酶活.由此表明，CALB在弱堿性條件下具有較好的穩(wěn)定性.

2.4.3 金屬離子和表面活性劑的影響 不同的金屬離子和表面活性劑對重組CALB的影響結(jié)果如圖6所示，發(fā)現(xiàn)Zn2+對CALB的抑制作用最強(qiáng)，CALB酶活為未加金屬離子樣品的26.1%.Mg2+、Ni+、Co2+對酶活幾乎沒有影響;在 Ca2+、Mn2+、Cu2+、Ba2+的作用下，脂肪酶的酶活都有較多的下降.非離子表明活性劑 Triton X-100(體積分?jǐn)?shù)0.05%)可提高CALB的活性，而陰離子表面活性劑SDS(體積分?jǐn)?shù)0.1%)對CALB的活性略有抑制作用.

3 結(jié)論

但由于CALB的高成本難以實現(xiàn)工業(yè)應(yīng)用，本研究克隆CALB基因至畢赤酵母中進(jìn)行分泌型表達(dá)，通過活性平板篩選和高密度發(fā)酵，無需經(jīng)過純化步驟即得到較高純度的重組CALB，較高純度的重組CALB比酶活達(dá)到131.8 U/mg.重組CALB最適反應(yīng)溫度為40℃，最適pH值為8.0，重組CALB在55℃范圍內(nèi)保溫1 h，仍能保持48.5%的活力，重組的CALB在pH7.5～9.5之間的溶液中比較穩(wěn)定，發(fā)現(xiàn)Zn2+對CALB有強(qiáng)烈的抑制作用;Mg2+、Ni+和Co2+對酶活幾乎沒有影響;非離子表明活性劑Triton X-100可提高CALB的活性，而陰離子表面活性劑SDS對CALB的活性略有抑制作用.此結(jié)果與孫金鵬等［13］的研究結(jié)果差異較大，分析是和酶活測定方法不同有關(guān)，也可能和CALB基因來源的菌株不同有關(guān).后續(xù)研究會利用大孔樹脂等材料對CALB進(jìn)行固定化研究，有望進(jìn)一步降低CALB的使用成本.

［1］粟慧君，馬駿，蔡莉，等.合成有機(jī)載體固定化豬胰脂肪酶性質(zhì)研究［J］.四川師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2008，31(5):586-589.

［2］Uppenberg J，Hansen M T，Patkar S，et al.The sequence，crystal structure determination and refinement of two crystal forms of lipase B from Candida antarctica［J］.Structure，1994，2:293-308.

［3］Kirk O，Christensen M W.Lipases from Candida antarctica:unique biocatalysts from a unique origin［J］.Organic Process Research ＆ Development，2002，6(4):446-451.

［4］Senanayake S P J N，Shahidi F.Incorporation of docosahexaenoic acid(DHA)into evening primrose(Oenothera biennis L)oil via lipase-catalyzed transesterification［J］.Food Chemistry，2004，85(4):489-496.

［5］Sivalingam G，Chattopadhyay S，Madras G.Enzymatic degradation of poly(ε -caprolactone)，poly(vinylacetate)and their blends by lipases［J］.Chemical Engineering Science，2003，58(13):2911-2919.

［6］Rodriguez J M，Roura E，Contreras E.Biosynthesis of ethylbutyrate using immobilized lipase:a statistical approach［J］.Process Biochemistry，2005，40(1):63-68.

［7］Monteiro C M，Lourenco N M，Afonsoo C A.Separation of secondary alcohols via enzymatic kinetic resolution using fatty esters as reusable acylating agents［J］.Tetrahedron:Asymmetry，2010，21:952-956.

［8］De Gonzalo G，Brieva R，Sánchez V M，et al.Enzymatic resolution of trans-4-(4'-fluorophenyl)-3-hydroxymethylpiperidines，key intermediates in the synthesis of(-)-paroxetine［J］.J Organic Chem，2001，66(26):8947-8953.

［9］Barbosa O，Ortiz C，Torres R，et al.Effect of the immobilization protocol on the properties of lipase B from Candida Antarctica in organic media:Enantiospecific production of atenolol acetate［J］.J Mol Catalysis B:Enzymatic，2011，71(3/4):124-132.

［10］Jun C，BW J，Joo J C，et al.Thermostabilization of Candida antarctica lipase B by double immobilization:Adsorption on a macroporous polyacrylate carrier and R1silaffin-mediated biosilicification［J］.Proc Biochem，2013，48(8):1181-1187.

［11］Hoegh I，Patkar S，Halkier T，et al.Two lipases from Candida antarctica:cloning and expression in Aspergillus oryzae［J］.Canadian J Botany，1995，73(S1):869-875.

［12］Liu D，Schmid R D，Rusnak M.Functional expression of Candida antarctica lipase B in the Escherichia coli cytoplasm-a screening system for a frequently used biocatalyst［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2006，72:1024-1032.

［13］孫金鵬，錢圣一，敬科舉，等.南極假絲酵母脂肪酶B在畢赤酵母的表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究［J］.廈門大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2011，50(4):765-771.

［14］Han S Y，Pan Z Y，Huang D F，et al.Highly efficient synthesis of ethyl hexanoate catalyzed by CALB-displaying Saccharomyces cerevisiae whole-cells in non-aqueous phase［J］.J Molecular Catalysis B:Enzymatic，2009，59(1/3):168-172.

［15］ Kato M，F(xiàn)uchimoto J，Tanino T，et al.Preparation of a whole-cell biocatalyst of mutated Candida antarctica lipase B(mCALB)by a yeast molecular display system and its practical properties［J］.Appl Microbiology Biotechnology，2007，75(3):549-555.

［16］Sue M P，Mariana L F，Brian M N，et al.Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system［J］.Yeast，2005，22:249-270.

［17］Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-Dye binding［J］.Analytical Biochemistry，1976，72:248-254.

［18］李燕妮，衣婷婷，李龍森.南極假絲酵母脂肪酶在15 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)條件的研究［J］.化學(xué)與生物工程，2007，24(7):43-48.