張 伶， 陳 柳， 胡德鳳， 邢菲菲， 張 宏， 陳 放

(1.中國(guó)人民解放軍成都軍區(qū)總醫(yī)院腫瘤診治中心放療科，四川成都610083;2.四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川成都610101;3.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川成都610041)

惡性腫瘤居全球死亡原因的第二位，至今仍缺乏有效的治療方法.西紅花屬鳶尾科植物.西紅花提取物(SE)具有降血壓、抗血栓、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用.另外，近年研究還發(fā)現(xiàn)西紅花具有抑制多種惡性腫瘤增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程(肝癌、腸癌、前列腺癌、胃癌及宮頸癌等)［1-5］等抗腫瘤活性.其中抗腫瘤活性的主要成分是西紅花酸及西紅花糖苷［6］.然而由于原材料昂貴、理化性質(zhì)不明確、藥物性能穩(wěn)定性差等原因限制了西紅花抗腫瘤應(yīng)用的發(fā)展.然而化學(xué)合成的西紅花酸和西紅花糖苷彌補(bǔ)了以上不足，但其抗腫瘤作用有待證實(shí).本實(shí)驗(yàn)首次檢測(cè)了合成的西紅花酸及8種西紅花糖苷對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的體外抗腫瘤活性，并初步探討了其抗瘤機(jī)制.

1 材料、試劑與儀器

材料:人結(jié)腸癌細(xì)胞系 HCT116、HT-29、LOVO、SW480、SW620、人胸腺癌細(xì)胞系 MCF-7、人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、人肝癌細(xì)胞系BELE-7402由四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供.提取SE的西紅花原料購(gòu)于四川中藥材有限公司，經(jīng)四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院陳放教授鑒定為鳶尾科植物西紅花(Saffron)干燥的花莖;合成的西紅花糖苷由四川師范大學(xué)張宏教授實(shí)驗(yàn)室合成并提供，經(jīng)核磁共振(NMR)及質(zhì)譜(MS)確定其結(jié)構(gòu)，由HPLC測(cè)定其純度均≥98%(見圖1).

試劑:抗人p53單克隆抗體(中國(guó)中杉金橋公司);MTT試劑盒(美國(guó)Sigma公司).

儀器:酶標(biāo)儀、Western blot轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-RAD公司);流式細(xì)胞儀(美國(guó)COULTER公司).

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 西紅花有效成分的提取 取西紅花干燥柱頭30 g，加入300 mL體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇，超聲提取30 min，過(guò)濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無(wú)乙醇，冷凍干燥，得西紅花提取物(saffron extraction，SE)，備用.

2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 待測(cè)細(xì)胞以每孔2.5×103個(gè)接種于96孔板.加實(shí)驗(yàn)樣品(處理藥物)100 μL，濃度為 0、0.937 5、1.875、3.75、7.5、15 μM，每組9孔，分別孵育 24、48、72 h.每組及空白取3孔，加20 μL MTT溶液，孵育2 h.棄液，加200 μL DMSO及甘氨酸緩沖液25 μL.酶標(biāo)儀讀取光密度，波長(zhǎng)570 nm，記錄吸光值分別為 OD0、OD實(shí)驗(yàn)、OD空白.計(jì)算抑制率 =［(OD0-OD空白)-(OD實(shí)驗(yàn)-OD空白)］/(OD0-OD空白).

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和周期 待測(cè)細(xì)胞接種于6孔板.加濃度為IC50的實(shí)驗(yàn)樣品2 mL，處理72 h.收集細(xì)胞，加體積分?jǐn)?shù)70%的冰乙醇固定，4℃過(guò)夜，離心.PBS重懸，離心.加1 mL PI染液，4℃避光30 min.流式細(xì)胞儀分析PI熒光直方圖，收集數(shù)據(jù)，Mutlciyde軟件計(jì)算Gl期、S期和G2期細(xì)胞的相對(duì)比值.

2.4 Western blot檢測(cè)p53的表達(dá) 待測(cè)細(xì)胞用RIPA裂解液重懸、超聲、離心，收集蛋白樣品.測(cè)量總蛋白質(zhì)量濃度:取蛋白樣品40 μg，用體積分?jǐn)?shù)12%的分離膠溶液進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE);260 mA橫流濕轉(zhuǎn)90 min，體積分?jǐn)?shù)5%脫脂牛奶封閉，一抗4℃過(guò)夜，PBS洗滌3次，二抗避光2 h，TBST洗滌2次.顯色液按照1∶1比例避光覆蓋PVDF膜，曝光顯影.

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析.各組均數(shù)采用方差分析與S-N-K檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

3 結(jié)果和結(jié)論

3.1 合成的西紅花糖苷對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響

表1 在不同濃度的SE作用下A549細(xì)胞系的生長(zhǎng)抑制率Table 1 The proliferation inhibition rates of A549 with different concentration of SE

表2 濃度為15 μM的SE及合成的西紅花糖苷作用下A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率Table 2 The proliferation inhibition of A549 using concentration of 15 μM SE or synthetic crocins

1)不同濃度的SE及合成的西紅花糖苷分別作用于8種腫瘤細(xì)胞株HCT116、HT-29、LOVO、SW620、SW480、A549、BELE-7402、MCF-7 不同時(shí)間.檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，抑制率隨實(shí)驗(yàn)樣品濃度及處理細(xì)胞時(shí)間的增加而增加，以SE作用于A549細(xì)胞為例，當(dāng)濃度為0.937 5 μM時(shí)，細(xì)胞的生長(zhǎng)和未處理組無(wú)明顯差異(P＞0.05)，而當(dāng)濃度為15 μM時(shí)，處理組細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，24 h時(shí)抑制率為 0.377，48 h為 0.418 7，72 h時(shí)為0.422，即隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，其抑制率逐漸增加;當(dāng)不同濃度的SE作用于A549細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)作用在相同的時(shí)間點(diǎn)上其抑制率隨SE濃度的增加而增加(表1).另外，與 SE 比較，crocetin、crocin I～I(xiàn)II體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用顯著，而crocin IV體外抑制作用與SE相當(dāng)，crocin V～VIII抑制作用略遜于SE(表2).在相同濃度實(shí)驗(yàn)樣品的作用下，A549細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率依次為crocin I、crocin II＞crocetin、crocin III＞crocin IV＞SE＞crocin V＞crocin VI＞crocin VIII＞crocin VII(圖2和表2).以上實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，crocetin、crocin I～I(xiàn)II體外抑制腫瘤增殖作用較SE更加明顯，crocin IV體外抑制作用與SE相當(dāng).

2)用相同濃度的SE及合成的西紅花糖苷作用于 8種腫瘤細(xì)胞株 HCT116、HT-29、LOVO、SW620、SW480、A549、BELE-7402、MCF-7 相同時(shí)間，觀察腫瘤細(xì)胞對(duì)其的敏感性.其中HCT116細(xì)胞對(duì) crocetin、crocin I～crocin II的作用較為敏感，A549細(xì)胞對(duì)crocetin、crocin I～crocin IV作用較為敏感，BELE-7402細(xì)胞對(duì)crocin III的作用較為敏感，而SE、crocin V～crocin VIII作用于此8種腫瘤細(xì)胞均沒(méi)有較為敏感的菌株(圖3，其中“*”表示實(shí)驗(yàn)樣品抑制該腫瘤細(xì)胞的增殖作用與其他腫瘤細(xì)胞比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)).因此以腫瘤抑制作用較為明顯的crocetin、crocin I～crocin IV作為觀察樣品組，用HCT116、A549作為靶細(xì)胞，進(jìn)行抗腫瘤作用機(jī)制的相關(guān)研究.

3.2 合成的西紅花糖苷對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)合成的crocetin、crocin I～crocin IV 作用下 HCT116、A549細(xì)胞的凋亡(表3、圖4及5).與未處理的空白對(duì)照組比較，crocetin、crocin I和 crocin II可以誘導(dǎo) HCT116細(xì)胞凋亡(圖4)，crocetin、crocin I和crocin IV則能促進(jìn)A549細(xì)胞的凋亡(圖5).

3.3 合成的西紅花糖苷對(duì)細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)合成的crocetin、crocin I～crocin IV作用下HCT116、A549細(xì)胞有絲分裂周期的結(jié)果(表4和5).與空白對(duì)照組腫瘤細(xì)胞比較，在各自濃度為IC50的 crocetin、crocin I～crocin IV 的作用下，HCT-116、A549G2期的細(xì)胞比例明顯減少，G1/G2期細(xì)胞比例明顯增加，較多腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)停滯在G1期.以上數(shù)據(jù)說(shuō)明西紅花糖苷可能對(duì)腫瘤細(xì)胞分裂周期中相關(guān)蛋白質(zhì)的合成具有抑制作用.

表3 HCT116、A549在合成的西紅花糖苷作用下的凋亡率Table 3 The apoptosis rates of HCT116 and A549 with synthesis crocins %

表4 HCT116在合成的西紅花糖苷作用下的細(xì)胞周期情況Table 4 The cell cycle process of HCT-116 with synthetic crocins %

表5 A549在合成的西紅花糖苷作用下的細(xì)胞周期情況Table 5 The cell cycle process of A549 with synthetic crocins %

3.4 合成的西紅花糖苷對(duì)p53基因表達(dá)的影響p53是對(duì)細(xì)胞周期和凋亡起關(guān)鍵作用的抑癌基因.本實(shí)驗(yàn)給予濃度為IC50的SE及合成的西紅花糖苷藥物作用于HCT116、A549腫瘤細(xì)胞.Western blot檢測(cè)表明，與 SE比較，經(jīng)crocetin、crocin I～crocin IV處理后，p53基因表達(dá)明顯增加(圖6、圖7).因此，合成的西紅花糖苷誘導(dǎo)HCT116、A549細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期進(jìn)程阻滯的機(jī)制可能與促進(jìn)p53蛋白的表達(dá)有關(guān).

4 討論

近年不少研究人員發(fā)現(xiàn)西紅花主要成分具有潛在的抗腫瘤活性，但諸多原因限制了西紅花的進(jìn)一步研究及開發(fā).本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與西紅花提取物SE比較，合成的crocetin、crocin I～crocin III在體外可以顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖.另外，合成的西紅花糖苷能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞于有絲分裂G1期，減少G2期腫瘤細(xì)胞的DNA合成;其抗腫瘤機(jī)制可能與上調(diào)p53表達(dá)相關(guān).

SE中的主要成分有西紅花酸、西紅花素、西紅花酸二甲酯等，有降血脂、抗氧化、興奮子宮、活血等功效［7］.另外國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明，西紅花提取物可在體內(nèi)外抑制多種腫瘤細(xì)胞(如肝癌、腸癌、胃癌、前列腺癌、宮頸癌、乳腺癌等)［1-5，8］增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，抑制DNA和RNA合成.而在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要負(fù)性作用的主要物質(zhì)是西紅花酸及西紅花糖苷［6］.本實(shí)驗(yàn)中合成的西紅花糖苷具有相似的抗癌活性，且crocetin、crocetin I～I(xiàn)II抑制細(xì)胞增殖作用優(yōu)于SE，該結(jié)果為替代SE，進(jìn)一步研發(fā)抗癌新藥提供了理論依據(jù).

合成的西紅花糖苷作用于5種不同的大腸癌細(xì)胞，其敏感依次為:HCT116(p53野生型)＞LOVO(p53野生型)、HT-29(p53突變型)＞SW480、SW620(p53突變型);而西紅花糖苷調(diào)控HCT116細(xì)胞周期停滯在G1期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)p53的表達(dá)也有不同程度的上調(diào).同樣，H.H.Aung等［9］也發(fā)現(xiàn)，在SE或提取的crocins作用下，HCT116的生長(zhǎng)較SW480、HT-29受到明顯抑制.其機(jī)制為p53野生型及突變型腫瘤細(xì)胞分別通過(guò)p53依賴的及 p53 非依賴途徑激活 p21WAF1/Cip1［10-11］，后者抑制細(xì)胞周期依賴性激酶(CDKS)或生長(zhǎng)增殖核抗原(PCNA)活性從而調(diào)控細(xì)胞周期于G1期.另外，研究表明SE可誘導(dǎo)兩種同源的HCT116(HCTp53陽(yáng)性和HCTp53陰性)細(xì)胞凋亡及胞內(nèi)DNA損傷，但死亡細(xì)胞碎片的自噬延遲誘導(dǎo)HCTp53陰性細(xì)胞凋亡［2］.因此，腫瘤細(xì)胞的p53狀態(tài)一定程度地影響著西紅花對(duì)其的細(xì)胞周期進(jìn)程及細(xì)胞凋亡.但是否完全適用于合成的西紅花糖苷，以及其具體的機(jī)制等仍需進(jìn)一步研究.

西紅花具有潛在的抗腫瘤活性，且對(duì)正常細(xì)胞的毒性很小［5，9］，是極有應(yīng)用前景的抗癌藥物.而與SE比較，合成的西紅花糖苷用于腫瘤治療具有如下優(yōu)勢(shì):1)量:目前，西紅花稀少，價(jià)格昂貴，有“植物黃金”之稱［12］;而化學(xué)合成可批量得到西紅花糖苷，成本低廉.2)理化性質(zhì):與SE比較，合成的西紅花糖苷成分單一，化學(xué)結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單，理化性質(zhì)清楚，藥物性能穩(wěn)定，有利于分析其各成分的作用.3)抗腫瘤活性:可以通過(guò)化學(xué)合成選擇抗癌活性顯著的藥物.本研究創(chuàng)新性地選擇出較SE具有更強(qiáng)體外抗腫瘤活性的合成的西紅花糖苷，并初步探討了其抗腫瘤機(jī)制，為探尋更理想的西紅花類抗腫瘤藥物提供了體外研究的依據(jù).

［1］Amin A，Hamza A A，Bajbouj K，et al.Saffron:a potential candidate for a novel anticancer drug against hepatocellular carcinoma［J］.Hepatology，2011，54(3):857-867.

［2］Bajbouj K，Schulze-Luehrmann J，Diermeier S，et al.The anticancer effect of saffron in two p53 isogenic colorectal cancer cell lines［J］.BMC Complement Altern Med，2012，12:69.

［3］Samarghandian S，Shabestari M M.DNA fragmentation and apoptosis induced by safranal in human prostate cancer cell line［J］.Indian J Urol，2013，29(3):177-183.

［4］Bathaie S Z，Miri H，Mohagheghi M A，et al.Saffron aqueous extract inhibits the chemically-induced gastric cancer progression in the Wistar Albino Rat［J］.Iran J Basic Med Sci，2013，16(1):27-38.

［5］Abdullaev F I，Espinosa-Aguirre J J.Biomedical properties of saffron and its potential use in cancer therapy and chemoprevention trials［J］.Cancer Detect Prev，2004，28:426-432.

［6］張宏，張俊國(guó)，張伶，等.西紅花有效成分研究進(jìn)展［J］.化學(xué)研究與應(yīng)用，2009，21(6):794-800.

［7］胡江寧，姚德中，章江生，等.西紅花抗腫瘤作用的研究進(jìn)展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42(3):699-701，703.

［8］Mousavi S H，Tavakkol-Afshari J，Brook A，et al.Role of caspases and Bax protein in saffron-induced apoptosis in MCF-7 cells［J］.Food Chem Toxicology，2009，47(8):1909-1913.

［9］Aung H H，Wang C Z，Ni M，et al.Crocin from Crocus sativus possesses significant anti-proliferation effects on human colorectal cancer cells［J］.Exp Oncol，2007，29:175-180.

［10］Zhong Y J，Shi F，Zheng X L，et al.Crocetin induces cytotoxicity and enhances vincristine-induced cancer cell death via p53-dependent and-independent mechanisms［J］.Acta Pharmacologica Sinica，2011，32:1529-1536.

［11］Li C Y，Huang W F，Wang Q L，et al.Crocetin induces cytotoxicity in colon cancer cells via p53-independent mechanisms［J］.Asian Pacific J Cancer Prev，2012，13:3757-3761.

［12］張宏.西紅花有效成分-西紅花糖苷分離方法和機(jī)理的研究及應(yīng)用［D］.成都:四川大學(xué)，2001.