張茂杰 馬美湖

(蛋品加工技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070)

禽類蛋殼基質(zhì)蛋白質(zhì)含量為0.89%～1.18%，蛋殼含有2%的有機質(zhì)，其中70%是蛋白質(zhì)，11%是多糖［1］，100 g 蛋殼粉平均含有 28.8～54.4 mg的酸溶蛋白質(zhì)［2］。在蛋殼形成的鈣化階段，子宮液中檢測到一系列分子質(zhì)量14～180 ku的特異性蛋白質(zhì)，可分為ovocleidins和ovocalyxins兩大類，前者主要有ovocleidin-17(OC-17)、ovocleidin-116(OC-116)，后者主要有 ovocalyxin-21(OCX-21)、ovocalyxin-25(OCX-25)、ovocalyxin-32(OCX-32)和ovocalyxin-36(OCX-36)。OCX-36在蛋殼、殼膜中含量豐富，具有抑菌等生物活性。通過免疫熒光技術(shù)檢測，表征其生物學(xué)功能可以評估禽蛋的自然防御能力，從而降低消費者攝入雞蛋導(dǎo)致的食源性疾病的風險。本文就OCX-36在禽蛋中的分布、基因結(jié)構(gòu)以及生物活性等研究做簡要綜述，旨在為研究該蛋白質(zhì)提供參考。

1 OCX-36在蛋殼中分布及來源

2007年法國國家農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所的 Jo?l Gautron和 其 團 隊 首 先 命 名 了 ovocalyxin-36［3］(ovum，拉丁語，卵的意思;calyx，拉丁語，殼的意思［4］。此詞可翻譯為卵殼素-36)，OCX-36是一種在蛋殼高效鈣化時表達的蛋白質(zhì)，主要位于蛋殼內(nèi)層和殼膜，由453個氨基酸組成，分子質(zhì)量36 ku，已知其 cDNA 序列全長 1 995 bp［3］。肉仔雞OCX-36基因序列和斑馬雀(56%)同源性較接近。同 OC-17、OC-116和 OCX-32基因相比，OCX-36基因在物種間高度保守。

光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡膠體金免疫標記定位研究證實，整個蛋殼中的OCX-36在與膜相鄰的殼的內(nèi)側(cè)區(qū)域(乳頭錐體層)具有最強的免疫染色，是蛋殼、蛋殼膜中豐度最高的蛋白質(zhì)［3］。利用RT-PCR技術(shù)對OCX-36起源的研究表明，OCX-36 mRNA的表達發(fā)生在蛋殼形成(峽部和子宮)以及消化道的輸卵管區(qū)域等鈣化發(fā)生組織［5-6］。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)分析，蛋殼在形成過程中，蛋白質(zhì)混合物組分，包括以水溶性前體存在的蛋殼基質(zhì)成分，在鈣化過程不同階段的變化相當大，特別是32～36 ku蛋白質(zhì)在生長活躍階段尤為明顯［3］。

在蛋殼形成的鈣化階段，子宮液中的OCX-36含量較高，它只在子宮中表達。進入子宮后，表達受到增量調(diào)控，因此，這種蛋白質(zhì)可能是控制蛋殼形成的重要因素。排卵后的18 h在白峽、紅峽以及子宮中均能檢測出，只有宮旁組織在排卵3 h之后才能檢測到［3］。OCX-36蛋白質(zhì)在輸卵管的管腔內(nèi)的傳輸路徑為從紅峽和子宮向白峽遷移，這可以解釋其與殼膜形成的關(guān)聯(lián)。1.5 h內(nèi)通過白峽，沉積為高度交聯(lián)的胞外纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的蛋殼膜形成了最內(nèi)層的殼膜。這些纖維作為用于酶和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)支撐，可以防止微生物的入侵［7-11］。在孵化(雞胚尿囊膜分泌響應(yīng)酸)之前，乳頭層鈣儲備體溶解，這個過程會溶解OCX-36，蛋殼變得越來越?。?2］。

Mann［10］在卵黃膜中也檢測出了 OCX-36，同時也對火雞的蛋殼蛋白質(zhì)的基因組序列進行分析，結(jié)果表明OC-116和OCX-36占已鑒定蛋白質(zhì)的37%，未檢出雞蛋殼中其他的特異蛋白質(zhì)［11］。

2 OCX-36的基因結(jié)構(gòu)

禽蛋特異性蛋白質(zhì)的演變與脊椎動物繁衍的進化是相關(guān)的。OCX-36是鳥類高度特異性的基因，出現(xiàn)在鳥類和哺乳動物分化之后，源于原始殺菌通透性增加蛋白質(zhì)/脂多糖結(jié)合蛋白質(zhì)/腭肺鼻上皮癌關(guān)聯(lián)蛋白質(zhì)(BPI/LBP/PLUNC)基因簇的順接重復(fù)［12-13］。從系譜樹鑒定出原雞屬OCX-36基因和其他哺乳類原雞屬普通BPI/LBP/PLUNC基因的直系同源關(guān)系。搜索雞的基因庫進行核苷酸序列比對，OCX-36基因嵌套在 BPI/LBP/PLUNC基因簇的20號染色體上，靠近 BPI L3，LPLUNC 3，4，在核苷酸 9834141和 9842177之間，基因組序列長8 037 bp，由15個大小在43(外顯子12)～477 bp(外顯子15)不等的外顯子與14個尺寸范圍從80(內(nèi)含子10)～1 185 bp(內(nèi)含子11)的內(nèi)含子組成。OCX-36基因的外顯子/內(nèi)含子構(gòu)成與LBP和BPI的基因是非常相似、高度保守的，與相應(yīng)的外顯子具有相同的尺寸［3，14］。

圖1 OCX-36蛋白質(zhì)與人脂多糖結(jié)合蛋白質(zhì)、人殺菌通透性增加蛋白質(zhì)基因結(jié)構(gòu)的對比Fig.1 Comparison of the genomic structure of human LBP，human BPI and OCX-36 proteins［3］

同線分析結(jié)果表明，在脊椎動物原始基因中至少有1個PLUNC基因，此外，BPI/LBP/PLUNC基因簇在脊椎動物中是保守的［13］。OCX-36出現(xiàn)在雞形目基因組而不在哺乳類基因組。tBlastn數(shù)據(jù)搜索，在哺乳類和硬骨魚均未發(fā)現(xiàn)OCX-36的匹配，表明OCX-36是原雞屬特有的。在EMBL數(shù)據(jù)庫中進行核苷酸序列比對搜索，也沒有檢測到任何其他序列顯著的同源性。與此相反，氨基酸序列比對搜索結(jié)果顯示與哺乳動物LBP、BPI和膽固醇酯轉(zhuǎn)運蛋白以及PLUNC家族蛋白質(zhì)有20%～25%同源。

OCX-36條帶N-末端氨基酸測序，得到的序列為VLSGLSCAISPRAMQQV，OCX-36的氨基酸序列殘基33-244和273-439分別對應(yīng)于LBP/BPI蛋白質(zhì)家族結(jié)構(gòu)域的N-末端和C-末端。真核生物線性序檢測到在位置23～26有1個可能的糖胺聚糖附著功能性位點，但是直接測序法并不能檢測到這種轉(zhuǎn)譯后修飾作用。預(yù)測的蛋白激酶C催化的磷酸化位點絲氨酸-31、絲氨酸-63和絲氨酸-323，或酪蛋白激酶2催化的磷酸化位點蘇氨酸-135、蘇氨酸-145和絲氨酸-304，通過肽測序法均未檢測到［3］。

3 OCX-36的作用與機制

3.1 影響蛋殼的形成與品質(zhì)

殼基質(zhì)蛋白質(zhì)對蛋殼的形成有調(diào)控作用。試驗表明剛收集的新鮮子宮液會發(fā)生CaCO3的自動聚沉，沉淀的顆粒包裹著特定的子宮液蛋白質(zhì)，并且子宮液能改變CaCO3體外條件下的沉淀動力學(xué)特性。Gautron等［14］通過試驗證明蛋雞輸卵管液里有殼基質(zhì)蛋白質(zhì)的前體，證實了殼基質(zhì)蛋白質(zhì)參與蛋殼礦化過程，而OCX-36在蛋殼鈣化過程中起著正調(diào)節(jié)的作用［3］，這符合其在蛋殼形成階段表達上調(diào)這一現(xiàn)象。

基質(zhì)蛋白質(zhì)同時在生物礦化過程和決定機械性能的方面發(fā)揮了重要作用。蛋殼鈣化過程中，方解石晶體的生長競爭與基質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用，形成高度復(fù)雜有序的生物礦化結(jié)構(gòu)。

Falini等［15］指出，殼層中的可溶性蛋白質(zhì)決定了CaCO3的晶型，同時CaCO3晶體的形貌還與基質(zhì)蛋白質(zhì)的濃度有關(guān)。晶體的形貌是由各個方向上晶體的相對生長速率決定的。可溶性蛋白質(zhì)選擇性地吸附在生長晶體的特定晶面上，改變了不同晶面的相對生長速率，從而導(dǎo)致晶體改變，影響晶體的形貌。Rodriguez-Navarro等［16］發(fā)現(xiàn)蛋殼的晶體結(jié)構(gòu)和蛋殼強度之間有顯著的相關(guān)性。隨著蛋雞年齡變大，蛋殼有機基質(zhì)發(fā)生變化。結(jié)構(gòu)分析顯示，老齡蛋雞的蛋殼中有2個優(yōu)先的晶體取向，而育成雞的蛋殼中只有1個。老齡蛋雞的蛋殼斷裂強度是育成雞的1/2，并且在結(jié)構(gòu)性能如厚度、顆粒形態(tài)和晶體結(jié)構(gòu)方面表現(xiàn)出較大變異性。據(jù)此可以推測作為殼基質(zhì)蛋白質(zhì)中豐度較大的蛋白質(zhì)，OCX-36對蛋殼的品質(zhì)有一定的影響。

3.2 抑菌活性與機制

禽蛋組分對病原體的天然抗病性決定于蛋殼的物理屏障和化學(xué)防御，因為抑菌蛋白質(zhì)和肽是由輸卵管的管腔細胞分泌并成為蛋清、蛋殼膜和蛋殼的成分。禽類OCX-36是BPI/LBP/PLUNC基因位點的成員，其蛋白質(zhì)序列與哺乳動物BPI/LBP的相似，在基因結(jié)構(gòu)上，LBP、BPI和 OCX-36有很高的保守性，顯示出在進化過程中的關(guān)聯(lián)性［17］。據(jù)此假設(shè) OCX-36 具有抑菌活性［3-4］。

3.2.1 抑菌活性

Wellman-Labadie等［18］研究了啞天鵝(Cygnus olor)、棕脅秋沙鴨(Lophodytes cucullatus)、林鴛鴦(Aix sponsa)、加拿大黑雁(Branta canadensis)4種雁形目蛋殼蛋白質(zhì)提取物的抑菌活性。殼基質(zhì)蛋白質(zhì)提取物能夠抑制金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(Escherichia coli)D31、綠膿桿菌(Pseudomonas aureginosa)和枯草芽孢桿菌(Bacillus cereus)，其中從棕脅秋沙鴨蛋殼中提取的蛋白質(zhì)尤為有效。

Mine等［2］從蛋殼中提取出含有OCX-36的蛋殼基質(zhì)蛋白質(zhì)混合物。將此混合物按100μg/mL的濃度與微生物一起孵育，發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)混合物可以有效抑制枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌的活性，在孵育早期(孵育4 h前)對大腸桿菌和腸炎沙門氏菌也有一定的抑制作用。

3.2.2 與脂磷壁酸/脂多糖(LTA/LPS)的結(jié)合活力

純化的OCX-36的抗菌活性及其結(jié)合LTA和LPS的能力評估試驗表明，OCX-36蛋白質(zhì)能夠顯著抑制金黃色葡萄球菌ATCC6538的細胞活力，抑菌效果呈劑量和時間依賴性，且不同濃度的抑制效果不一樣;源于母雞基因分型的脯氨酸-71(Pro-71)和絲氨酸-71(Ser-71)這2個類型的OCX-36的抑菌活性亦很顯著［19］。

LBP和BPI是PLUNC蛋白質(zhì)家族的成員。這2種蛋白質(zhì)成員結(jié)合LPS，并在LPS介導(dǎo)的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮拮抗作用。人LBP增強了LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，而BPI表現(xiàn)出抗菌和消炎作用［20-21］。人 PLUNCs分為短 PLUNCs(SPLUNCs 1、2 和 3)和長 PLUNCs(LPLUNCs 1、2、3、4 和 6)蛋白質(zhì)。SPLUNCs和LPS具有同源性，結(jié)合BPI的N-末端結(jié)構(gòu)域，而LPLUNCs和BPI的2個N-末端和C-末端具有整體同源性。BPI的N-端結(jié)構(gòu)域負責其中和細胞內(nèi)毒素和抗菌活性，調(diào)理活性與它的C-末端結(jié)構(gòu)域相關(guān)［22］。OCX-36蛋白質(zhì)是BPIFB蛋白家族中的新成員，SPLUNC根被BPIFA 取 代，LPLUNC 根 被 BPIFB 替 換［23］。SPLUNC 1能夠抑制綠膿桿菌生長和結(jié)合LPS［24］。SPLUNC 1對銅綠假單胞菌的體外抗菌作用是SPLUNC 1蛋白質(zhì)增加細菌細胞的通透性，在感染部位具有趨化巨噬細胞和嗜中性粒細胞的作用［25］。SPLUNC 1顯示了顯著的抗支原體肺炎活性，輕微抑制大腸桿菌的生長［26］。PLUNC蛋白質(zhì)結(jié)合LPS，具有抑菌活性，誘導(dǎo)細菌凝集，并參與細胞因子的產(chǎn)生［27］。基于OCX-36與BPI/LBP/PLUNC蛋白質(zhì)具有共同的結(jié)構(gòu)特征，推測OCX-36也參與了對病原體的先天性免疫反應(yīng)［4］。

分別采用革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的細胞壁成分，即病原體相關(guān)的分子模式(PAMP)，研究OCX-36是否結(jié)合LPS和LTA。PAMP的一些實例包括LTA、LPS和脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)。OCX-36表現(xiàn)出顯著的結(jié)合大腸桿菌O111∶B4脂蛋白能力，表明其與BPI和LBP相似，參與宿主防御抵御細菌。OCX-36也從金黃色葡萄球菌ATCC 6538上結(jié)合LTA，這說明其抑制金黃色葡萄球菌的生長很可能依賴于它與細菌細胞壁LTA的相互作用。在與金黃色葡萄球菌LTA結(jié)合時，Pro-71形式的OCX-36的LTA結(jié)合活性比兩者混合以及Ser-71形式的OCX-36蛋白質(zhì)要顯著［19］。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)OCX-36蛋白質(zhì)可能是以通過破壞細菌細胞膜的完整性的方式達到抑菌作用。

4 小 結(jié)

目前，國內(nèi)外對該蛋白質(zhì)的相關(guān)性研究尚處于起步階段，OCX-36的抑菌活性已經(jīng)得到了充分的證明，然而抑菌機理還沒有進行深入的研究。蛋白質(zhì)的抗菌性能與蛋殼相關(guān)聯(lián)，改變蛋殼的性質(zhì)直接關(guān)系到增加蛋的污染風險和消費者食源性疾病的暴發(fā)，研究環(huán)境和飼料的因素影響該蛋白質(zhì)的活動或者含量，選擇增加該蛋白質(zhì)的含量，優(yōu)化禽蛋的自然防御系統(tǒng);將OCX-36用作生物標記分子物，觀察其在胚胎發(fā)育過程的防御作用，以及如何保護未受精的卵子抵御致病菌的侵染，這些研究將有助于減少禽蛋食源性疾病的發(fā)生。此外，蛋殼基質(zhì)成分在調(diào)控蛋殼形成和蛋殼機械性能方面起積極作用，OCX-36在蛋殼鈣化過程中和方解石晶體的相互作用機制還有待進一步研究。最后，研究OCX-36的結(jié)構(gòu)可以更好的發(fā)現(xiàn)及解釋其生物活性。

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