劉 杰，包瑩玲，陳小龍

(浙江工業(yè)大學(xué) 發(fā)酵工程研究所，浙江 杭州 310014）

井岡霉素能有效的抑制水稻、小麥和玉米等禾本科作物的紋枯病菌，自70年代開發(fā)至今，因其高效低毒的特性，已成為水稻紋枯病防治中最主要的藥劑，也是國內(nèi)生產(chǎn)量最大的微生物農(nóng)藥[1-2]。井岡霉素在我國已經(jīng)使用了近40年，全國有30多家工廠生產(chǎn)[3]，年產(chǎn)量3萬～4萬噸，年防治面積約1000億平方米。

井岡霉素中的主要活性組分為井岡霉素A。當(dāng)前生產(chǎn)井岡霉素A的方法主要是微生物發(fā)酵。生物合成井岡霉素A的方法原料來源廣泛并且對(duì)環(huán)境無污染，然而生產(chǎn)效率低、產(chǎn)量低、能耗高等問題一直是影響其擴(kuò)大使用范圍的重要因素。因此，本實(shí)驗(yàn)嘗試運(yùn)用生物工程技術(shù)手段，獲得高效表達(dá)目的產(chǎn)物的菌株，提高井岡霉素A的產(chǎn)量。這對(duì)于降低企業(yè)生產(chǎn)成本，減少對(duì)環(huán)境的影響具有重要意義。

在研究生物合成井岡霉素A反應(yīng)的限速步驟時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)井岡霉素A的生產(chǎn)菌種在最后一步將井岡羥胺A轉(zhuǎn)化為井岡霉素A的效率偏低，而催化此反應(yīng)的酶為糖基轉(zhuǎn)移酶。李磊[4]通過基因置換實(shí)驗(yàn)和回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證明基因valG編碼的蛋白確實(shí)能行使糖基轉(zhuǎn)移的功能。徐慧等[5]通過以井岡霉亞基胺A作為糖基受體，以UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖、UDP-氮-乙酰氨基葡萄糖、UDP-葡萄糖醛酸和GDP-麥芽糖作為ValG的糖基供體，在Mg2+存在下反應(yīng)，TLC檢測反應(yīng)產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)，ValG可以利用UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖作為糖基供體，生成4''-表-井岡霉素A （4''-epi-validamycin A）。4''-表-井岡霉素A是井岡霉素A的同分異構(gòu)體，包含半乳糖結(jié)構(gòu)。

周祥等[6]通過接合轉(zhuǎn)移的方法對(duì)糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行過量表達(dá)。但是，由于吸水鏈霉菌對(duì)外源DNA具有較強(qiáng)的限制性。不同質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效果具有較大差異，井岡霉素的產(chǎn)量并未得到明顯提高。陳雙雅等[7]對(duì)建立吸水鏈霉菌的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)進(jìn)行過探究，證實(shí)了不同質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率不同。于秀蓮等[8]探究了吸水鏈霉菌原生質(zhì)體的制備條件，得到了制備吸水鏈霉菌原生質(zhì)體的最佳條件。

本實(shí)驗(yàn)嘗試對(duì)糖基轉(zhuǎn)移酶基因進(jìn)行過量表達(dá)以提高井岡霉素A的產(chǎn)量。利用質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化吸水鏈霉菌感受態(tài)細(xì)胞，所用質(zhì)粒為穿梭質(zhì)粒pIJ8630，該質(zhì)粒具有紅霉素強(qiáng)啟動(dòng)子PermE*，且有大腸桿菌和鏈霉菌的接合轉(zhuǎn)導(dǎo)元件OriT，以及int和attP位點(diǎn)，可以整合到鏈霉菌基因組上與基因組一起復(fù)制。

1 材料與方法

1.1 菌株及質(zhì)粒

Escherichia coli DH5α，E.coli ET12567，吸水鏈霉菌 （Sterptomyces hygroscopicus subsp.jinggangensis），pIJ8630 均由本實(shí)驗(yàn)室保存，pMD-19購自TaKaRa公司。

1.2 培養(yǎng)基與試劑等

限制性內(nèi)切酶KpnⅠ，NotⅠ，T4DNA連接酶，DNA聚合酶，UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒和SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒等均購自上海生工生物工程公司；測序由華大基因公司提供。

發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉50 g，黃豆餅粉40 g，酵母膏 10 g，NaCl 1 g，KH2PO41 g， 蒸餾水 1000 mL。

LB固體培養(yǎng)基：酵母粉5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，瓊脂 15 g，水 1000 mL，pH 7.0。

R2YE液體培養(yǎng)基：先按以下成分配制：蔗糖103 g，葡萄糖 10 g，蛋白胨 4 g，酵母浸出粉4 g，胰蛋白胨2 g，酪蛋白水解物1 g，K2SO40.25 g，MgCl2·2H2O 10.12 g，微量元素溶液 2.0 mL，蒸餾水1000 mL。上述培養(yǎng)基分裝于250 mL錐形瓶中，每瓶 50 mL，滅菌(115℃，20 min)后加入下列溶液：KH2PO4（0.5%）1 mL，CaCl2（0.25 mol/L）8 mL，Tris·HCl(pH 值為 7.2)10 mL。

微量元素溶液（mg/L）：ZnCl240 mg，Na2B4O7·10H2O 10mg，F(xiàn)eCl3·6H2O 200 mg， (NH4)6Mo7O24·4H2O 10 mg，CuCl2·2H2O 10 mg， MnCl2·4H2O 10 mg，蒸餾水 1000 mL。

滲 透 壓 穩(wěn) 定 液 ：K2SO40.25 g，MgC12·6H2O 2g，蔗糖103 g，微量元素溶液2 mL，用蒸餾水定容至 800 mL，115℃滅菌 30 min。滅菌后加入：KH2PO4（0.5%）10 mL，CaCl2（0.25 mol/L）100 mL，Tris·HCl(pH 值為 7.2)100 mL。

Tris·HCl（pH 值為 7.2）溶液：稱量 Tris 3.03 g,用蒸餾水70 mL溶解后,用濃鹽酸調(diào)pH值為7.2，然后定容至 100 mL，115℃滅菌 30 min。

1.3 儀器

島津LC-21AT高效液相色譜儀。

1.4 valG基因的PCR擴(kuò)增和克隆

根據(jù)Genbank中糖基轉(zhuǎn)移酶ValG的基因序列，設(shè)計(jì)了一對(duì)用于擴(kuò)增valG基因的引物，

ValG F:5’-GGGGTACCATGCCCGGTGCGACATC-3’

ValG R:5’-ATAAGAATGCGGCCGCTCAGTCACCGCGAAGAGAC-3’

PCR擴(kuò)增條件 ：94℃ 2 min，94℃ 45 s →55℃ 30 s→ 72℃ 1 min（30個(gè)循環(huán)），72℃延伸 10 min。PCR產(chǎn)物切膠后用膠回收試劑盒回收，連接到pMD-19載體，構(gòu)建成的質(zhì)粒pMD-19-valG轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，使用小量細(xì)菌質(zhì)粒抽提試劑盒提取克隆質(zhì)粒，經(jīng)KpnⅠ、NotⅠ雙酶切驗(yàn)證為陽性克隆后測序。

1.5 穿梭質(zhì)粒pIJ8630-valG的構(gòu)建

測序結(jié)果正確的質(zhì)粒以KpnⅠ、NotⅠ雙酶切，回收valG基因并將其插入同樣經(jīng)KpnⅠ、NotⅠ雙酶切處理的pIJ8630，酶切驗(yàn)證后測序，未發(fā)生移碼的質(zhì)粒即為構(gòu)建成功的穿梭質(zhì)粒pIJ8630-valG。

1.6 吸水鏈霉菌感受態(tài)細(xì)胞的制備

取10 mL菌液置于50 mL離心管中，3000 rpm離心10 min，收集菌絲體。棄去上清，在沉淀中加10 mL滲透壓穩(wěn)定液，3000 rpm離心10 min。重復(fù)洗滌菌絲體1次后加入10 mL滲透壓穩(wěn)定液。加溶菌酶（2 g/L）后置于37℃水浴中保溫酶解1 h。在整個(gè)酶解過程中，每隔10 min輕輕振蕩1次，以便促使原生質(zhì)體從菌絲體上游離下來。酶解后，于3000 rpm離心 7 min，棄去上清液。加10 mL滲透壓穩(wěn)定液，洗凈溶菌酶。經(jīng)兩層擦鏡紙過濾后得到原生質(zhì)體懸液。取一滴原生質(zhì)體懸液于血球計(jì)數(shù)板上,在顯微鏡下準(zhǔn)確計(jì)數(shù)，得到原生質(zhì)體總數(shù)。

1.7 質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化吸水鏈霉菌感受態(tài)細(xì)胞

根據(jù)要做的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)數(shù)，分裝50 μL原生質(zhì)體(大約1010/mL)于各個(gè)EP管中。加5 μL DNA溶液到原生質(zhì)體中。立即加入200 μL含25%PEG的緩沖液，用微量移液器上下吹吸4次以使其充分混合。放置3 min，將轉(zhuǎn)化后的懸液 (100～200 μL)涂布于2個(gè)已吹干的R2YE平板上。將平板置于28℃恒溫培養(yǎng)。16 h后用含有抗生素的軟營養(yǎng)瓊脂倒上層平板上。4天后進(jìn)行抗性菌落計(jì)數(shù)。挑取接合子，進(jìn)行PCR反應(yīng)驗(yàn)證。

1.8 HPLC檢測井岡霉素A

通過HPLC檢測發(fā)酵產(chǎn)物中井岡霉素A，分析valG基因的表達(dá)狀況。將足量孢子接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)（180 rpm）48～72 h。 發(fā)酵液離心后取上清直接進(jìn)行檢測。選用ODSZHYPERSIL色譜柱，流動(dòng)相為5 mmol/L磷酸氫二鈉緩沖液：甲醇(HPLC級(jí)100%)=98：2(V:V)，流速1.0 mL/min，檢測波長210 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 valG基因的PCR擴(kuò)增和克隆

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳顯示約為1269 bp的片段，見圖1。

pMD-19-valG經(jīng)KpnⅠ、NotⅠ雙酶切處理顯示2692 bp的載體和約1269 bp的插入片段，見圖2。

圖1 PCR擴(kuò)增糖基轉(zhuǎn)移酶基因

圖2 重組質(zhì)粒pMD-19-valG雙酶切電泳結(jié)果

pMD-19-T Simple Vector是一種高效克隆PCR產(chǎn)物（TA Cloning）的專用載體。具有PCR產(chǎn)物連接、克隆效率高的特點(diǎn)，并且菌落顯示的時(shí)間短，克隆后更易進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。因此，本實(shí)驗(yàn)首先通過TA克隆將目的基因片段插入pMD-19中，以便于穿梭質(zhì)粒pIJ8630-valG的構(gòu)建。

2.2穿梭質(zhì)粒pIJ8630-valG的構(gòu)建

將瓊脂糖凝膠中回收的擴(kuò)增產(chǎn)物用Kpn I和Not I進(jìn)行酶切，割膠回收?？刂艱NA片段摩爾數(shù)是載體摩爾數(shù)的3～10倍，將目的片段與Kpn I和Not I雙酶切后的載體 pIJ8630混合，16℃下 T4DNA連接酶連接過夜。

質(zhì)粒pIJ8630-valG具有紅霉素強(qiáng)啟動(dòng)子PermE*，且有大腸桿菌和鏈霉菌的接合轉(zhuǎn)導(dǎo)元件OriT，以及int和attP位點(diǎn)，可以整合到鏈霉菌基因組上與基因組一起復(fù)制。首先將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli ET12567，在含有安普霉素的LB平板上獲得抗性菌落，然后挑選單菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)。提取重組質(zhì)粒，雙酶切驗(yàn)證。結(jié)果表明，抗性菌落均含有重組質(zhì)粒pIJ8630-valG，從而為質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化吸水鏈霉菌感受態(tài)細(xì)胞準(zhǔn)備了材料。

pIJ8630-valG經(jīng)KpnⅠ、NotⅠ雙酶切處理顯示6.9kb的載體和約1269bp的插入片段，見圖4。

圖3 穿梭質(zhì)粒pIJ8630-valG構(gòu)建示意圖

圖4 重組質(zhì)粒pIJ8630-valG雙酶切電泳結(jié)果圖

圖5 重組吸水鏈霉菌DNA PCR電泳圖

2.3 質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化吸水鏈霉菌及驗(yàn)證

通過質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化吸水鏈霉菌感受態(tài)細(xì)胞將質(zhì)粒pIJ8630-valG轉(zhuǎn)入吸水鏈霉菌中，用安普霉素覆蓋4～5天后有白色接合轉(zhuǎn)移子長出，將長出的接合轉(zhuǎn)移子接種于無抗性的SFM平板上，培養(yǎng)5天挑取單菌落，即得到抗性正確的接合子。將篩選到的抗性正確的接合子提取DNA進(jìn)行PCR驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期吻合（見圖5)，證明突變株構(gòu)建成功。

由圖6和7可知，重組菌株與出發(fā)菌株相比基本形態(tài)一致，質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化后的重組菌菌落中間突起部分邊緣的凹痕增大，并且有黑色素產(chǎn)生，菌落顏色變?yōu)榛液谏?。圖7為安普霉素抗性平板上的轉(zhuǎn)化子單菌落。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化吸水鏈霉菌感受態(tài)細(xì)胞較易得到大量轉(zhuǎn)化子?？赡苡捎谖溍咕诩?xì)胞壁被溶解后，通透性大大增強(qiáng)，有利于質(zhì)粒的進(jìn)入和表達(dá)。

2.4 突變株發(fā)酵液的HPLC檢測

檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中井岡霉素A的產(chǎn)量為1.17 mg/mL，比出發(fā)菌株提高了11.2%，valG基因得到了表達(dá)。

3 討論

井岡霉素自上世紀(jì)70年代以來，在很長時(shí)期內(nèi)獨(dú)霸我國水稻紋枯病防治的市場份額。但是，近年來，隨著新型產(chǎn)品的不斷涌現(xiàn)，井岡霉素的市場份額已經(jīng)被逐步侵食。新型農(nóng)藥用量少、藥效長，總體成本低于井岡霉素。因此，如何提高井岡霉素中有效成分井岡霉素A的產(chǎn)量，進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本成為亟待解決的問題。井岡霉素A由糖基轉(zhuǎn)移酶基因valG編碼的糖基轉(zhuǎn)移酶將β-D-葡萄糖轉(zhuǎn)移到井岡霉亞基胺A的4’-羥基位置生成。本文通過基因改造的方法成功構(gòu)建了穿梭質(zhì)粒pIJ8630-valG并導(dǎo)入吸水鏈霉菌中，使糖基轉(zhuǎn)移酶基因valG得到正確表達(dá)。

4 結(jié)論與展望

圖6 出發(fā)菌株

圖7 重組菌株

本文通成功構(gòu)建了穿梭質(zhì)粒pIJ8630-valG并導(dǎo)入吸水鏈霉菌中，使糖基轉(zhuǎn)移酶基因valG得到正確表達(dá)。證實(shí)了糖基轉(zhuǎn)移酶基因valG在井岡霉素A的合成過程中的作用。提高了井岡霉素A的產(chǎn)量，為進(jìn)一步利用糖基轉(zhuǎn)移酶基因valG改造構(gòu)建新的高產(chǎn)菌株提供了理論基礎(chǔ)。

在進(jìn)行質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化吸水鏈霉菌時(shí)，不同質(zhì)粒的效果會(huì)明顯不同，日后可嘗試通過構(gòu)建多種質(zhì)粒進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移以期提高效率。另外，井岡霉素A合成的必須基因有八個(gè)，分別為valA、valB、valC、valG、valK、valL、valM 和 valN。可以探究其它基因的高拷貝菌株構(gòu)建或者多個(gè)基因高拷貝菌株的構(gòu)建以提高井岡霉素A的產(chǎn)量。

[1]Faust B,Hoffmeister D,Weitnauer G,et a1.Two new tailoring enzymes,a glycosyltransferase and an oxygenase,involved in biosynthesis of the angucycline antibiotic urdamycin A in Streptomyces fradiae Tu2717[J].Microbiology,2000,146(1):147-l54.

[2]沈寅初．農(nóng)用抗生素研究開發(fā)的新進(jìn)展.國外醫(yī)藥一抗生素分冊(cè)[J]．1998，19（2）：155-160．

[3]朱昌雄，陳守文，劉放，等．我國發(fā)酵微生物農(nóng)藥的發(fā)展概況與趨勢(shì)[J]．生物加工過程，2003，1（1）：37-41．

[4]李磊，白林泉，鄧子新．井岡霉亞基胺A高產(chǎn)突變株的構(gòu)建[J]．上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，42（5）：689-692．

[5]Xu H,Minagawa K,Bai L,et al.Catalytic analysis of the validamycin glycosyltransferase(ValG)and enzymatic production of 4''-epi-validamycin A[J].J Nat Prod.2008,71(7):1233-1236.

[6]Zhou X,Wu H,Li Z,et al.Over-expression of UDP-glucose pyrophosphorylase increases validamycin A but decreases validoxylamine A production in Streptomyces hygroscopicus var.jinggangensis 5008[J].Metabolic Engineering.2011,13(6):768-776.

[7]陳雙雅，鄧子新．吸水鏈霉菌井岡變種JG5008轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的初建[J]．應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2000，6(3)：267-270．

[8]于秀蓮，張怡軒，石喬等．吸水鏈霉菌井岡變種原生質(zhì)體的制備與再生[J]．沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，25（5）：315-319．