劉志強(qiáng) ，趙軍子 ，李，王克明

（1.浙江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058，2.浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 杭州 310012）

在世界范圍內(nèi)，由于環(huán)境質(zhì)量的惡化和生態(tài)平衡的失調(diào)，人們已由過去廣泛對(duì)空氣、水污染的關(guān)注和重視逐漸擴(kuò)展為對(duì)凡可能對(duì)人體健康有影響的各個(gè)方面的關(guān)注。因此，近年來掀起了一場(chǎng)世界性的“回歸自然”、“綠色消費(fèi)”的浪潮。在這一浪潮的沖擊下，世界各國都在積極開展生產(chǎn)有利于環(huán)境保護(hù)，有益于人體健康的各種綠色商品，如綠色食品、綠色化妝品、綠色紡織品等。微生物生產(chǎn)天然染色劑，既高產(chǎn)又綠色環(huán)保，有著廣闊前景。紅曲霉發(fā)酵的研究以固態(tài)和液態(tài)發(fā)酵的研究較多[1-2]。采用固定化細(xì)胞技術(shù)可大大提高紅曲色素發(fā)酵產(chǎn)量[3-5]。近年有報(bào)道紅曲霉發(fā)酵過程添加酵母發(fā)酵液促進(jìn)紅曲色素產(chǎn)量的報(bào)道[6-8]。本研究以固定化雙菌耦合發(fā)酵生產(chǎn)紅曲紅色素進(jìn)行了探索。

1 材料與方法

1．1 試劑

海藻酸鈉(Merck CO.Inc)；酵母膏(Difcp laboratories)；其余試劑均為分析純。

1．2 菌株和培養(yǎng)基

1.2.1 菌種

紅曲霉(Monascus M101)經(jīng)誘變所得的高產(chǎn)變異菌株，酵母(Saccharomyces cerevisiae)均由浙江科技學(xué)院生物工程實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2.2 斜面培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

紅曲霉的培養(yǎng)：

麥芽汁瓊脂斜面培養(yǎng)基 (濃度均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))：葡萄糖1%，酵母膏0.3%，麥芽汁粉0.2%，蛋白胨0.3%，瓊脂2%，pH 6，滅菌.接種后30℃培養(yǎng)5～6 d。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖7%，蛋白胨3%，NaNO30.2%，MgSO4·7H20 0.1%，pH 自然，115℃，25 min滅菌。

酵母的培養(yǎng)：

麥芽汁瓊脂斜面培養(yǎng)基 （濃度均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：葡萄糖1%，酵母膏0.3%，麥芽汁粉0.2% ，蛋白陳 0.3%，瓊脂 2%，pH 6，滅菌、接種后 30℃培養(yǎng) 1～2 d。

發(fā)酵培養(yǎng)基：同紅曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基。

培養(yǎng)條件：從活化2 d的麥芽汁斜面上挑取酵母接種到液體培養(yǎng)基中，于30℃，120 r/min搖床培養(yǎng) 1～3 d。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 固定化細(xì)胞粒子的制備

取培養(yǎng)5 d的紅曲霉菌斜面，取用10 mL的無菌水洗下表面的孢子，置于裝有玻璃珠的50 mL無菌水三角燒瓶中，在120 r/min的條件下振蕩1 h。取培養(yǎng)2 d的釀酒酵母斜面（與紅曲菌差時(shí)培養(yǎng)）加入10 mL無菌生理鹽水制備酵母菌懸液后。將兩種菌的菌懸液（孢子濃度為6×106/mL左右）分別與滅過菌的4%海藻酸鈉溶液混勻后分別滴入5%CaCl2無菌溶液中，于4℃下鈣化2 h制成直徑為3-4 mm的球形粒子并以無菌生理鹽水洗滌2-3次備用。

1.3.2 固定化細(xì)胞粒子的培養(yǎng)

鈣化后的兩種微生物固定化粒子加于增殖培養(yǎng)基。置于30℃，160 r/min的條件下的搖床中進(jìn)行增殖培養(yǎng)2～3 d。

1.3.3 分析檢測(cè)定方法[8,12]

發(fā)酵液過100目篩，準(zhǔn)確吸取5 mL發(fā)酵液于試管中，加入95%乙醇，振蕩提取1 h后3000 r/mim，離心30 min，取上清液5 mL于試管中加水稀釋。稀釋液用721分光光度計(jì)用0.5 cm比色皿測(cè)420 nm和520 nm的吸光度。色價(jià)計(jì)算公式如下：

色價(jià)(U/mL)=OD420×稀釋倍+OD520×稀釋倍

水溶性色素的分析

發(fā)酵液經(jīng)紗布過濾，將濾液3000 r/min離心30 min，取上清液5 mL于試管中，加水稀釋。稀釋液用721分光光度計(jì)于0.5 cm比色皿測(cè)420 nm和520 nm的吸光度。色價(jià)計(jì)算公式如下：

色價(jià)(U/mL)=OD420×稀釋倍+OD520×稀釋倍

2 結(jié)果與討論

紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)色素過程中對(duì)其影響素因素較多[1-3,6,8]。本試驗(yàn)在對(duì)紅曲霉菌細(xì)胞固定化發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化中側(cè)重研究酵母與紅曲霉共固定化混合發(fā)酵促進(jìn)色素產(chǎn)生的影響：共固定化細(xì)胞粒子中紅曲霉菌與釀酒酵母的菌量配比及共固定化細(xì)胞重復(fù)發(fā)酵產(chǎn)色素的穩(wěn)定性方面考進(jìn)行考察。

2.1 紅曲霉菌固定化細(xì)胞的發(fā)酵條件研究

2.1.1 紅曲霉菌固定化細(xì)胞的發(fā)酵最適pH值的確定

紅曲在培養(yǎng)基中能充分繁殖并生成大量的色素，培養(yǎng)基適宜pH值是至關(guān)重要的[1,10-11]。首先進(jìn)行紅曲霉菌固定化細(xì)胞的發(fā)酵最適pH值的試驗(yàn)。將發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值分別設(shè)定為3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0 進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1。

表1 紅曲霉固定化細(xì)胞發(fā)酵培養(yǎng)基適宜pH值情況

由表1可看出發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值為5～6時(shí)，紅曲霉固定化細(xì)胞發(fā)酵色素產(chǎn)量較高。故以下實(shí)驗(yàn)發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值均調(diào)為5～6。

2.1.2 紅曲霉菌固定化細(xì)胞發(fā)酵適宜溫度的確定

溫度是影響微生物的生長與代謝的重要因素。為了考察培養(yǎng)紅曲霉菌發(fā)酵產(chǎn)色素的適宜溫度，實(shí)驗(yàn)分別設(shè)定了 20℃，25℃，30℃，32℃，35℃，40℃的發(fā)酵溫度進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2。

表2 紅曲霉固定化細(xì)胞發(fā)酵適宜溫度情況

由表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)溫度為30℃時(shí)，紅曲色素產(chǎn)量高，因此以下實(shí)驗(yàn)發(fā)酵溫度為30℃。

2.1.3 紅曲霉固定化細(xì)胞發(fā)酵適宜通氣量的確定

紅曲為好氣性菌，它的耗氧量隨著它的生理狀態(tài)的不同而異，其細(xì)胞的生長與色素的形成都需要有足夠的氧氣供給[3,9]。為達(dá)到最高的色素產(chǎn)量與最低的動(dòng)力消耗，優(yōu)化適宜的溶解氧的供給是極為必要的。為此，在通入恒定壓力的壓縮空氣，分別以 0.1 vvm，0.15 vvm，0.25 vvm，0.35 vvm，0.5 vvm進(jìn)行培養(yǎng)試驗(yàn)。

表3 紅曲霉固定化細(xì)胞發(fā)酵適宜通氣量情況

由表3的結(jié)果可知，隨著通氣量的增加，紅曲的代謝速度加快，菌體量和色素產(chǎn)量增加。但是當(dāng)通氣量由0.35 vvm增加至0.5 vvm時(shí)色素產(chǎn)量增加幅度并不大，故通氣量以選用0.35 vvm為宜。

2.1.4 紅曲霉固定化細(xì)胞發(fā)酵適宜細(xì)胞接入量的確定

接種量的多少對(duì)微生物的發(fā)酵有著重要影響。為了考察接種量對(duì)紅曲霉發(fā)酵中菌體生長和色素產(chǎn)量的影響，分別設(shè)定了紅曲霉固定化細(xì)胞粒子的接入量為 10%，15%，20%，25%，30%的紅曲霉固定化細(xì)胞粒子，發(fā)酵周期為60 h。

表4 紅曲霉固定化細(xì)胞粒子的接入量情況

由表4的結(jié)果可知，隨著固定化細(xì)胞粒子接入量的加大，發(fā)酵液中色素濃度的積累加快。當(dāng)固定化細(xì)胞粒子接入量由20%增為25%時(shí)，色價(jià)由243.9 U/mL增加至245.3 U/mL，可見隨著固定化細(xì)胞接入量的增加到一定值，紅曲霉產(chǎn)色素的色價(jià)增加并不十分顯著，加大接種量會(huì)增加菌種制備的工作量和降低生物反應(yīng)器的有效工作體積。因此，紅曲霉固定化細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)紅曲色素時(shí)固定化細(xì)胞粒子的接入量選取為20%為宜。

從上述的紅曲霉菌的固定化細(xì)胞培養(yǎng)的各項(xiàng)單因素實(shí)驗(yàn)可看出，紅曲霉菌固定化細(xì)胞發(fā)酵培養(yǎng)的適宜條件為：pH為6左右，接種量20%左右，發(fā)酵溫度為30℃左右，通氣量為0.35 vvm左右。

2.2.1 紅曲霉菌與酵母菌共固定化細(xì)胞的發(fā)酵培養(yǎng)

在紅曲霉菌與酵母菌混合共固定化細(xì)胞的發(fā)酵培養(yǎng)適宜條件的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了雙菌混合菌體量配比比例對(duì)發(fā)酵產(chǎn)色素的影響實(shí)驗(yàn)，設(shè)定發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為6，接種量20%，發(fā)酵溫度為30℃，通氣量為0.35 vvm。紅曲霉菌與酵母菌混合比 例 設(shè) 為 ：1:0，1:1，1.5:1，2:1，2.5:1，3:1，3.5:1，4:1，4.5:1，5:1進(jìn)行雙菌共固定化耦合發(fā)酵考察實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表5。

表5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，紅曲霉菌與酵母菌混合固定化細(xì)胞粒子中，酵母菌的代謝分泌產(chǎn)物對(duì)紅曲霉菌形成色素有刺激促進(jìn)作用。隨著固定化粒子內(nèi)紅曲霉菌菌量與酵母菌菌量的混合比例在一定的范圍內(nèi)遞增這種刺激促進(jìn)作用增大。從紅曲霉菌與酵母菌共固定化細(xì)胞的雙菌混合配比對(duì)發(fā)酵產(chǎn)色素實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，紅曲霉菌與酵母菌混合比例為1:0時(shí)色價(jià)為238 U/mL；而紅曲霉菌與酵母菌混合菌量比為1:1時(shí)，紅曲霉產(chǎn)色素的色價(jià)僅為73 U/mL；而當(dāng)紅曲霉菌與酵母菌混合菌量配比4:1時(shí)紅曲霉產(chǎn)色素的色價(jià)為389 U/mL，而后隨紅曲霉菌與酵母菌混合配比量的繼續(xù)加大，當(dāng)菌體量配比為5:1時(shí)色價(jià)反而下降為237 U/mL。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，紅曲霉菌與酵母菌混合比例為1:1時(shí)，可能由于酵母菌的菌體量過大其代謝產(chǎn)物分泌量也較大。過量的代謝分泌產(chǎn)物對(duì)紅曲霉菌產(chǎn)色素產(chǎn)生非但沒有促進(jìn)反而產(chǎn)生抑制效應(yīng)；而當(dāng)兩種微生物的菌體量的混合配比量為5:1時(shí)，紅曲霉產(chǎn)色素的色價(jià)降低為237 U/mL，這可能是由于紅曲霉菌與酵母菌混合固定化細(xì)胞粒子中的酵母菌體量過少其代謝產(chǎn)物量不足，導(dǎo)致刺激促進(jìn)作用削減。從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出紅曲霉菌與酵母菌混合固定化細(xì)胞粒子中紅曲霉菌菌體量與酵母菌體菌量的混合配比為4:1時(shí)酵母菌的代謝分泌產(chǎn)物對(duì)紅曲菌產(chǎn)色素的刺激促進(jìn)作用的強(qiáng)弱適中。

表5 紅曲霉菌與酵母菌配比混合固定化細(xì)胞培養(yǎng)的情況

2.2.2 紅曲霉菌與酵母菌混合固定化細(xì)胞粒子的重復(fù)發(fā)酵

固定化細(xì)胞技術(shù)的主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)所在就是固定化細(xì)胞粒子可重復(fù)使用。固定化細(xì)胞發(fā)酵性能的穩(wěn)定及固定化細(xì)胞粒子機(jī)械強(qiáng)度是考核固定化細(xì)胞性能的重要指標(biāo)。對(duì)紅曲霉菌與酵母菌混合共固定化細(xì)胞進(jìn)行了20批次的重復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，考察其產(chǎn)色素穩(wěn)定情況，結(jié)果如表6所示。

從表6的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，采用紅曲霉菌與酵母菌混合共固定化發(fā)酵紅曲色素，固定化細(xì)胞經(jīng)20批次重復(fù)發(fā)酵，紅曲霉菌與酵母菌混合固定化細(xì)胞產(chǎn)色素一直穩(wěn)定在較高水平。同時(shí)從實(shí)驗(yàn)看出，以4%濃度的海藻酸鈉作為固定化凝膠，固定化細(xì)胞粒子的機(jī)械強(qiáng)度效果較好。

3 討論

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出：①采用固定化紅曲霉菌細(xì)胞發(fā)酵紅曲色素比紅曲霉菌游離細(xì)胞發(fā)酵紅曲色素產(chǎn)量有大幅度提高[3-5]。紅曲霉菌與酵母菌混合固定化細(xì)胞發(fā)酵過程中，紅曲霉菌產(chǎn)紅曲色素比紅曲霉菌單菌固定化發(fā)酵產(chǎn)紅色素提高了60%，說明紅曲霉菌與酵母菌混合固定化細(xì)胞耦合發(fā)酵是提高天然染色劑紅曲色素生產(chǎn)產(chǎn)量的可行而有效的途徑。②采用紅曲霉菌與酵母菌混合固定化耦合發(fā)酵紅曲色素產(chǎn)量相較于紅曲霉菌單細(xì)胞固定化發(fā)酵的大幅提高，說明了紅曲霉菌與酵母菌混合共固定化發(fā)酵紅曲色素的發(fā)酵過程中酵母菌的代謝分泌產(chǎn)物對(duì)紅曲霉菌細(xì)胞能刺激促進(jìn)紅曲霉菌紅色素的形成。推測(cè)可能是酵母生長代謝過程中所分泌的幾丁質(zhì)酶等可能是主要刺激因子[12]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明通過紅曲霉菌與酵母菌混合固定化細(xì)胞耦合發(fā)酵，提高天然染色劑紅曲色素產(chǎn)量的關(guān)鍵點(diǎn)是要控制適宜的兩種微生物的菌體量配比比例。③由于采用細(xì)胞包埋固定化法固定紅曲霉菌與酵母菌，發(fā)酵液中游離菌絲減少，所以發(fā)酵液黏度低，有利于氧氣及營養(yǎng)物的傳遞，更重要的是便于色素的分離和提取，有利于下游工序的操作進(jìn)而降低成本[1-2,5]。

表6 雙菌混合固定化細(xì)胞重復(fù)發(fā)酵產(chǎn)色素及固定化機(jī)械強(qiáng)度情況

[1]張名光，常韓生，林長勇．紅曲菌生產(chǎn)紅曲色素的研究[J]．食品與發(fā)酵工業(yè)，1982(6)：1-68．

[2]傅亮，周衛(wèi)兵，高孔榮．紅曲色素高產(chǎn)菌株發(fā)酵特性的研究[J]．食品科學(xué)，1996，17(3)：6-9．

[3]王克明．復(fù)合載體固定化細(xì)胞紅曲色素發(fā)酵條件的研究[J]．中國釀造，2005(6)：30-39．

[4]王克明，王雪筠．流加糖發(fā)酵提高紅曲色素產(chǎn)量的研究[J]．中國調(diào)味品，1995(6)：1-10．

[5]王克明．PVA固定化生產(chǎn)紅曲色素的研究[J]．煙臺(tái)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998(11)：306-309．

[6]王克明，鐘建江．利用紛絲廢液固定化紅曲發(fā)酵紅曲色素的講究[J]．菌物系統(tǒng)，2003（22）：136-139．

[7]Shin C S,Kim H J,Kim M J,et al.Morphological change and enhanced pigment production of Monascus when cocultured with Saccharomyces cerevisiae or Aspergillus oryzae[J].Biotechnology and bioengineering,1998,59(5):576-581.

[8]張泳權(quán)，張亮瑜，談家林．紅曲色素的分析測(cè)定[J]．食品與發(fā)酵工業(yè)，1985(6)：34-37．

[9]Evans P J,Wang H Y.Pigment production from immobilized Monascus sp.utilizing polymeric resin adsorption[J].Applied and environmental microbiology,1984,47(6):1323-1326.

[10]Wong H C,Koehler P.Production and isolation of an antibiotic from Monascus purpureus and its relationship to pigment production[J].Journal of Food Science,1981,46(2):589-592.

[11]Wang H C.Regulation of growth and antibiotic from Monascuspurreus by carbon and nitrogen concentration[J].Mycologia,1981,(73):649-658.

[12]天津輕工學(xué)院等．工業(yè)發(fā)酵分析[M]．北京：工業(yè)出版社，1980：1-421．