趙艷姣 崔亞利* 陳寶江 孫海云 李三嚇 李同洲

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，保定 071001;2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，保定 071001)

玉米是畜禽能量飼料的主要原料，在畜禽飼料中占有較高比例。玉米保管不當(dāng)很容易發(fā)霉，產(chǎn)生黃曲霉毒素(AF)、赤霉烯酮及嘔吐霉素(DON)等［1］，危害動(dòng)物的生長(zhǎng)、生產(chǎn)和繁殖，并具有劑量和時(shí)間依賴關(guān)系。唐雨蕊［2］通過給小鼠灌服250μg/kg體重的AFB1進(jìn)行攻毒處理，發(fā)現(xiàn)AFB1攻毒組小鼠腸道中的乳酸菌數(shù)量均下降，而腸桿菌總數(shù)均上升，表明腸道菌群的正常生態(tài)環(huán)境已遭到破壞，灌服乳桿菌組的雙歧桿菌數(shù)量顯著上升，腸桿菌數(shù)量則恢復(fù)為正常值，與對(duì)照組差異不顯著，提示AFB1可通過損傷肝臟功能，影響腸肝循環(huán)系統(tǒng)而破壞盲腸的微生態(tài)平衡，而灌服乳桿菌則可改善此影響。宋海彬等［3］通過對(duì)葡萄糖氧化酶的研究稱葡萄糖氧化酶系統(tǒng)名稱為β－D－葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)，飼料中添加一定量的GOD，可以抑制蛋雞盲腸內(nèi)大腸桿菌的增殖，GOD在催化反應(yīng)過程中生成的H2O2同時(shí)消耗大量的氧氣，H2O2可以抑制霉菌的生長(zhǎng)和增殖，降低霉菌毒素的含量，同時(shí)低氧的環(huán)境對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)和繁殖有促進(jìn)作用。GOD在催化腸道內(nèi)的葡萄糖發(fā)生反應(yīng)的過程中其反應(yīng)產(chǎn)物葡萄糖酸還可以降低胃腸內(nèi)pH，為乳酸桿菌的生長(zhǎng)創(chuàng)造了酸性環(huán)境，乳酸桿菌的大量生長(zhǎng)又有利于飼料的消化，對(duì)小鼠的平均日增重(ADG)有顯著提高的效果。同時(shí)，反應(yīng)生成的H2O2還具有滅菌的作用，當(dāng)H2O2積累到一定的濃度時(shí)，可直接抑制大腸桿菌等有害菌的生長(zhǎng)繁殖［4］。趙國(guó)先等［5］研究表明GOD能顯著降低肉雞空腸、回腸pH，具有明顯抑制大腸桿菌生長(zhǎng)、促進(jìn)盲腸中乳酸桿菌和雙歧桿菌增殖的作用。但有研究認(rèn)為GOD可顯著提高斷奶仔豬、斷奶仔兔的ADG和飼料轉(zhuǎn)化率，但不影響仔兔免疫器官的發(fā)育［6－7］。

GOD發(fā)揮作用的機(jī)理之一是能夠解除腸道霉菌毒素中毒及藥物中毒。飼料霉變是困擾飼料業(yè)和畜牧業(yè)的一個(gè)全球性難題，如何有效去除和降低霉菌毒素污染對(duì)動(dòng)物的危害已成為人們研究的重點(diǎn)。目前，關(guān)于GOD的研究多集中在對(duì)畜禽生產(chǎn)性能、腸道微生物和血清生化指標(biāo)的影響方面，對(duì)GOD緩解霉變飼料所引起慢性中毒的研究較少。本試驗(yàn)通過在昆明小鼠飼料中添加不同濃度霉變玉米面，旨在研究GOD制劑對(duì)ADG、腸道菌群變化的影響，為GOD制劑應(yīng)用于緩解霉變玉米所致畜禽中毒提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和飼料

從北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部購(gòu)入雄性清潔級(jí)昆明鼠130只，體重18～22 g，4周齡左右［試驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2011－0012］。從北京科澳協(xié)力飼料有限公司購(gòu)入小鼠粉狀維持料和顆粒料。

1.2 霉變玉米面的制作和檢測(cè)

1.2.1 霉變玉米面制備

恒溫培養(yǎng)箱溫度設(shè)定為(29±1)℃，濕度80%～85%，以利于霉菌的生長(zhǎng)。內(nèi)有蒸餾水的搪瓷盤置于培養(yǎng)箱內(nèi)以保持濕度。將盛有玉米面的滅菌搪瓷盤置于培養(yǎng)箱內(nèi)，每日觀察溫濕度和玉米面的發(fā)霉程度。

1.2.2 霉菌培養(yǎng)

取霉變8 d的玉米，采用高鹽察氏培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院測(cè)定AFB1含量為225.9 μg/kg，DON 含量為 1 023.10 μg/kg。

1.2.3 小鼠顆粒飼料的制作

根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在小鼠粉狀維持料中加入相應(yīng)比例的GOD制劑和霉變玉米，加水?dāng)嚢?。水與料的比例大概為1∶2，待混合料能握成團(tuán)但稍微一握還能松散時(shí)比較適宜。使用塑料漏斗制成柱狀顆粒料，50℃ 5～6 h烘干。

1.3 GOD 制劑

GOD制劑為保定鮮爾康生物工程有限責(zé)任公司生產(chǎn)，酶活力為150 000 U，麩皮作為載體。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和飼養(yǎng)管理

小鼠常規(guī)飼養(yǎng)7 d后開始試驗(yàn)，試驗(yàn)期為40和60 d。小鼠隨機(jī)分為13組，試驗(yàn)分組及處理見表1。10%霉變玉米面組飼料中AFB1含量為22.59 μg/kg，DON 含量為 102.31 μg/kg。20%霉變玉米面組飼料中 AFB1含量為 45.18μg/kg，DON含量為204.62μg/kg。30%霉變玉米面組飼料中 AFB1含量為 67.77 μg/kg，DON 含量為306.93 μg/kg。飼養(yǎng)在溫度為(25±3)℃，相對(duì)濕度為55%，自然光照的環(huán)境中。

表1 試驗(yàn)分組及處理Table 1 Experiment grouping and treatment

1.5 測(cè)定指標(biāo)和方法

1.5.1 體重測(cè)定

分別在飼喂發(fā)霉飼料的第1天、第20天、第40天、第60天時(shí)稱重。

1.5.2 樣品采集

在試驗(yàn)的第40天和第60天，各組隨機(jī)選取5只小鼠，禁食12 h后，稱重，頸椎脫臼法處死，刮取腸道(空腸、回腸和結(jié)腸)混合物食糜置于1.5 mL離心管中，－20℃冰凍保存。

1.5.3 腸道微生物檢測(cè)

從－20 ℃中取出食糜，快速稱取 0.2～0.3 g 放入試管內(nèi)，滅菌生理鹽水10倍稀釋，渦旋混合儀混合1～2 min，逐級(jí)稀釋，取預(yù)期梯度及左右各2個(gè)梯度的稀釋液0.1 mL，在培養(yǎng)基上涂布接種，每個(gè)梯度設(shè)2個(gè)重復(fù)，選取菌落數(shù)在5～100個(gè)的平皿進(jìn)行計(jì)數(shù)。大腸桿菌采用麥康凱瓊脂，空氣中37℃培養(yǎng)18 h。乳酸桿菌用乳酸桿菌選擇性瓊脂，厭氧環(huán)境37℃培養(yǎng)24 h，觀察計(jì)數(shù)。所用培養(yǎng)基均購(gòu)于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 16.0的單因素方差分析(one-way ANOVA)，并用LSD法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 GOD對(duì)小鼠ADG的影響

由表2可知，飼喂20 d時(shí)，添加3種不同濃度的GOD，對(duì)10%和30%霉變玉米面組小鼠ADG的影響不顯著(P＞0.05)。20%霉變玉米面飼料，添加0.1%和0.3%GOD組ADG顯著大于試驗(yàn)對(duì)照組(P＜0.05)。

表2 GOD對(duì)小鼠ADG的影響Table 2 Effects of GOD on average daily gain of mice g

飼喂40 d時(shí)，10%霉變玉米面飼料，添加GOD各組差異不顯著(P＜0.05)。20%霉變玉米面飼料，添加0.1%和0.3%GOD組 ADG極顯著高于試驗(yàn)對(duì)照組(P＜0.01)。30%霉變玉米面飼料，添加0.3%GOD組與其他各組比較ADG極顯著提高(P＜0.01)。

飼喂60 d時(shí)，10%霉變玉米面飼料，試驗(yàn)對(duì)照組ADG與空白對(duì)照組比較極顯著降低(P＜0.01)，添加 0.3%和 0.5%GOD 組與試驗(yàn)對(duì)照組比較ADG顯著增加(P＜0.05)，添加 GOD 3組之間差異不顯著(P＞0.05)。20%霉變玉米面飼料，試驗(yàn)對(duì)照組與空白對(duì)照組比較極顯著降低(P＜0.01)，添加 0.3%GOD 組與試驗(yàn)對(duì)照組、0.1%GOD組和0.5%GOD組比較，ADG極顯著增加(P＜0.01)。30%霉變玉米面飼料，試驗(yàn)對(duì)照組與空白對(duì)照組比較極顯著降低(P＜0.01)，添加 0.3%GOD組與試驗(yàn)對(duì)照組和0.1%GOD組比較ADG極顯著增加(P＜0.01)。

2.2 GOD對(duì)小鼠腸道微生物菌群的影響

2.2.1 GOD 對(duì)小鼠大腸桿菌的影響

由表3可知，小鼠飼料中添加霉變玉米面的試驗(yàn)對(duì)照組，腸道內(nèi)大腸桿菌數(shù)量與空白對(duì)照組比較極顯著增加(P＜0.01)。添加10%霉變玉米面，3種不同濃度的GOD組與試驗(yàn)對(duì)照組比較都極顯著降低了大腸桿菌數(shù)量(P＜0.01)。添加0.3%的GOD，飼喂60 d時(shí)大腸桿菌數(shù)量與飼喂40 d時(shí)比較極顯著降低(P＜0.01)。添加20%霉變玉米面，3種不同濃度的GOD組與試驗(yàn)對(duì)照組比較也都極顯著降低了大腸桿菌數(shù)量(P＜0.01)。0.3%和0.5%的GOD添加量抑菌效果較好。添加30%霉變玉米面，除飼喂40 d時(shí)0.1%GOD組與試驗(yàn)對(duì)照組差異不顯著(P＞0.05)外，GOD顯著或極顯著減少了腸道大腸桿菌的數(shù)量(P＜0.05或P＜0.01)，0.3%GOD 添加效果較好。

表3 GOD對(duì)小鼠腸道微生物的影響Table 3 Effects of GOD on intestinal microflora of mice lg(CFU/g)

2.2.2 GOD 對(duì)小鼠乳酸桿菌的影響

由表3可知，小鼠飼料中添加20%或30%霉變玉米面的試驗(yàn)對(duì)照組，腸道內(nèi)乳酸桿菌數(shù)量與空白對(duì)照組比較極顯著降低(P＜0.01)。添加10%霉變玉米面，0.3%和 0.5%GOD 組與試驗(yàn)對(duì)照組比較都極顯著增加了乳酸桿菌數(shù)量(P＜0.01)，2 組之間差異不顯著(P＞0.05)。飼喂 60 d時(shí)0.1%GOD組與試驗(yàn)對(duì)照組比較顯著增加了乳酸桿菌的數(shù)量(P＜0.05)。添加20%霉變玉米面，飼喂40 d時(shí)，與試驗(yàn)對(duì)照組比較，0.3%GOD顯著提高了乳酸桿菌的數(shù)量(P＜0.05)。60 d時(shí)，3種不同濃度的GOD組與試驗(yàn)對(duì)照組比較都極顯著提高了乳酸桿菌數(shù)量(P＜0.01)。添加30%霉變玉米面，飼喂60 d時(shí)，與試驗(yàn)對(duì)照組比較，0.1%、0.3%和0.5%的GOD添加量極顯著提高了腸道乳酸桿菌數(shù)量(P＜0.01)。

3 討論

3.1 GOD對(duì)小鼠ADG的影響

GOD在催化反應(yīng)過程中生成H2O2同時(shí)消耗大量的氧氣，H2O2可以抑制霉菌，降低霉菌毒素的含量，同時(shí)低氧的環(huán)境可減少飼料營(yíng)養(yǎng)的損失［3］。研究表明，GOD可提高斷奶仔豬、斷奶仔兔的日增重和飼料轉(zhuǎn)化率，不影響仔兔免疫器官的發(fā)育［6－7］。Yunus 等［8］研究表明霉變飼料能造成動(dòng)物多方面的危害已成為共識(shí)，不同動(dòng)物對(duì)AFB1的敏感性也不同，兔子的敏感性最強(qiáng)，依次為幼鴨、豬、狗、豚鼠、綿羊、小鼠、雞和大鼠。張磊［9］提出雛雞飼喂含黃曲霉毒素不是很高的霉玉米，臨床上雖無典型中毒表現(xiàn)，但是會(huì)使機(jī)體免疫機(jī)能下降，生長(zhǎng)發(fā)育受阻，體重增長(zhǎng)顯著減慢且參差不齊，飼料報(bào)酬率降低。王凱等［10］提出45日齡昆明小鼠飼喂自制霉變玉米餅4周后，小鼠體重都有不同程度的下降，而且影響小鼠的免疫功能，造成T、B淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)的改變。本試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果顯示，添加20%或30%霉變玉米面組，飼喂20、40和60 d后，0.3%的GOD對(duì)提高小鼠ADG效果較好，能顯著改善由于霉變玉米對(duì)ADG造成的不良效果，說明GOD能夠有效改善霉菌中毒對(duì)小鼠消化系統(tǒng)產(chǎn)生的直接毒害作用，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收。

3.2 GOD對(duì)小鼠腸道微生物的影響

李焰［11］研究表明在父母代蛋種雞育成料中添加GOD對(duì)由大腸桿菌等引起的腸道腹瀉有明顯的預(yù)防作用，對(duì)大腸桿菌病有明顯的預(yù)防及治療作用。楊久仙等［6］研究表明飼料中添加GOD可降低仔豬胃腸道內(nèi)大腸桿菌數(shù)量，增加乳酸桿菌的數(shù)量。由于GOD可催化葡萄糖酸的形成，所以可提供胃腸道的酸性環(huán)境。諸多研究表明，酸性條件可以抑制大腸桿菌等有害菌的生長(zhǎng)繁殖，而有利于乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖。Franco等［12］認(rèn)為添加磷酸型酸化劑A和乳酸型酸化劑B對(duì)體外培養(yǎng)的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌都有明顯抑制作用，不同比例的富馬酸和乳酸使腸道大腸桿菌數(shù)明顯減少。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼喂添加不同比例的霉變飼料后，GOD能顯著減少腸道內(nèi)大腸桿菌的數(shù)量，大腸桿菌的數(shù)量與GOD的添加量沒有明顯的劑量依賴關(guān)系;添加0.3%GOD提高乳酸菌數(shù)量的效果較好，而且隨著飼喂時(shí)間的延長(zhǎng)，效果更好。GOD可能通過降低小鼠腸道內(nèi)大腸桿菌的數(shù)量，提高腸道乳酸桿菌的數(shù)量，從而提高飼料的轉(zhuǎn)化率和吸收率，促進(jìn)小鼠的生長(zhǎng)。

4 結(jié)論

GOD能夠降低小鼠腸道內(nèi)大腸桿菌的數(shù)量，提高乳酸桿菌的數(shù)量，使小鼠ADG增加。飼料中AFB1含量低于 67.77 μg/kg時(shí)，添加 0.3%的GOD效果較好。這說明GOD能夠緩解霉變飼料對(duì)小鼠生長(zhǎng)造成的影響。

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