廖鏖，欒換東，李太元，李艷茹，許廣波(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉133002)

雞爪苓是我國(guó)長(zhǎng)白山區(qū)特有的野生豬苓(Polyponus umbellatus(Pers.)Fr)種屬，其菌核體形細(xì)長(zhǎng)，分枝較多，表面多褶皺，形如雞爪［1－4］。XING 等［5］通過(guò)對(duì)產(chǎn)自不同地區(qū)豬苓菌核的nrDNA ITS和28S rRNA(LSU)序列進(jìn)行比對(duì)分析后，提出雞爪苓與陜西等地所產(chǎn)豬苓的種內(nèi)遺傳背景不同，應(yīng)列為單獨(dú)類群。豬苓菌核是由大量菌絲體相互纏繞組成的休眠體，也是其藥用部位，具有利尿滲濕、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤的作用［6－9］。目前，國(guó)內(nèi)針對(duì)豬苓的研究主要集中于化學(xué)活性物質(zhì)的分離純化、藥理活性的測(cè)定和遺傳分類等方面，有關(guān)豬苓分子生物學(xué)方面的研究較少，劉開(kāi)輝等［10］通過(guò)rDNA，ITS(1，2)序列分析研究了不同地區(qū)豬苓的親緣關(guān)系，宋超等［11］克隆豬苓擬核cDNA，得到溶血素全長(zhǎng)cDNA。

cDNA文庫(kù)即生物在某個(gè)發(fā)育時(shí)期內(nèi)所轉(zhuǎn)錄的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA片段與載體連接而形成的包含全部mRNA信息的cDNA克隆集合［12］，主要包括全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)、均一化cDNA文庫(kù)和消減cDNA文庫(kù)。全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建、測(cè)序和功能注釋是了解生物體結(jié)構(gòu)和功能的重要方法［13］。筆者采用SMART技術(shù)，MMLV－RT反轉(zhuǎn)錄酶作用微量總RNA，快速構(gòu)建了雞爪苓菌絲體全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)，為研究雞爪苓生長(zhǎng)分化的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 雞爪苓菌絲體由采自長(zhǎng)白山區(qū)野生雞爪苓菌核經(jīng)組織分離后得到，菌株經(jīng)純化后保存于延邊大學(xué)微生物學(xué)與免疫學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心。

Trizol reagent購(gòu)于Invitrogen公司，SMARTTMcDNA Library Construction Kit User Manual，Advantage 2 PCR Kit購(gòu)于clontech公司，MaxPlaxTMLambda Packaging Extracts購(gòu)于Epicentre公司。

1.2 方法

1.2.1 雞爪苓菌絲體總RNA的提取。取經(jīng)純培養(yǎng)7、14、21、28 d的雞爪苓菌絲體，用液氮研磨成粉末(3次)，加入1 ml Trizol，按照Trizol reagent說(shuō)明書(shū)提取雞爪苓菌絲體的總RNA，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SMART法合成cDNA。加入總RNA、SMARTⅣ Oligonucleotide、CDS Ⅲ/3’PCR Primer，輕輕混勻后 72 ℃水浴 2 min，冰浴 2 min。再加入 5 × First-Strand Buffer、DTT、dNTP Mix、SMARTScribe MMLV RT，42 ℃水浴1 h，合成 First-Strand cDNA。取2 μl First-Strand cDNA至PCR管，加入去離子水、10 × Advantage 2 PCR buffer、50 × dNTP Mix、5'PCR Primer、CDSⅢ/3'PCR Primer和50×Advantage 2 Polymerase Mix。輕輕混勻后進(jìn)行LD-PCR，反應(yīng)條件:95℃ 1 min、95℃ 15 s、68℃ 6 min，22個(gè)循環(huán)，合成ds cDNA，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 cDNA的純化與酶切。將PCR產(chǎn)物用Proteinase K消化，酚仿抽提濃縮，用SfiⅠ酶切。采用CHROMA SPIN-400柱進(jìn)行分級(jí)分離，收集單滴組分于16個(gè)離心管中，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分級(jí)分離結(jié)果，收集大于500 bp的基因片段組分，用醋酸鈉、糖原和95%乙醇濃縮，溶解于7 μl去離子水中，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 λTripIEx2 載體的連接。分別取0.5、1.0 μl cDNA 與1 μl λTripIEx混合，加入T4連接酶，16℃過(guò)夜?；旌?管連接產(chǎn)物，包裝蛋白MaxPlaxTMLambda Packaging Extracts包裝連接產(chǎn)物，加入600 μl噬菌體稀釋緩沖液，25 μl氯仿，振蕩混勻，去沉淀，即為原始文庫(kù)。

1.2.5 原始文庫(kù)的檢測(cè)。將原始文庫(kù)稀釋10倍后，取1、10 μl與200 μl XL1-Blue的菌懸液混合，37 ℃孵育15 min，再加入IPTG和X-Gal各50 μl，移至3 ml頂層瓊脂培養(yǎng)基，均勻傾倒于LB/MgSO4平板，37℃培養(yǎng)，檢測(cè)噬菌斑藍(lán)白斑數(shù)。

1.2.6 文庫(kù)的擴(kuò)增及檢測(cè)。取10 μl原始文庫(kù)與500 μl XL1-Blue的菌懸液混勻，37℃孵育15 min，移至3 ml頂層瓊脂培養(yǎng)基，均勻傾倒于LB/MgSO4平板，37℃培養(yǎng)10 h，每個(gè)平板加10 ml噬菌體稀釋緩沖液，4℃過(guò)夜，室溫振蕩1 h后收集緩沖液，分裝至50 ml離心管，加入10 ml氯仿，7 000 r/min離心10 min，取上清，即為已擴(kuò)增雞爪苓菌絲體cDNA文庫(kù)，保存?zhèn)溆?。參照?.2.5”滴定擴(kuò)增的文庫(kù)(不加IPTG和X-Gal)。隨機(jī)選取23個(gè)噬菌斑，加入400 μl噬菌體稀釋緩沖液，4℃過(guò)夜。取1 μl模板進(jìn)行PCR鑒定。PCR反應(yīng)條件:94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，72 ℃ 10 min;30個(gè)循環(huán)。

1.2.7 EST分析。取5 μl雞爪苓菌絲體全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)，轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pTriplEx2載體。隨機(jī)選取20個(gè)單個(gè)菌落，采用菌落PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)入成功率。根據(jù)PCR結(jié)果，選擇6個(gè)片段較長(zhǎng)的cDNA進(jìn)行EST分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞爪苓菌絲體總RNA的提取 參照Trizol reagent試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取雞爪苓菌絲體總RNA(圖1)。結(jié)果顯示，菌絲體培養(yǎng)時(shí)間不同，總RNA的產(chǎn)率不同。7、14 d雞爪苓菌絲體總 RNA 的產(chǎn)量較高，分別為144.156、220.104 μg，28S與18S條帶清晰，比例約為1.5∶1.0。雞爪苓菌絲體培養(yǎng)21和28 d 產(chǎn)量較低，分別為71.638、3.580 μg，28S 與 18S 條帶清晰，比例約為 1.5∶1.0。

2.2 雞爪苓菌絲體的cDNA合成 用MMLV Reverse Transcriptase將雞爪苓菌絲體總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，通過(guò)LD-PCR合成雙鏈cDNA。電泳檢測(cè)，cDNA彌散于500～2 500 bp(圖2)，符合cDNA文庫(kù)建庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 Trizol法提取不同時(shí)間段雞爪苓菌絲體總RNA

表1 不同時(shí)間段雞爪苓菌絲體總RNA的提取

圖2 LD-PCR合成產(chǎn)物雙鏈cDNA

圖3 雞爪苓菌絲體cDNA的分級(jí)分離

2.3 cDNA片段的分級(jí)分離 雞爪苓菌絲體cDNA經(jīng)SfiI酶切后，用CHROMA SPIN-400柱進(jìn)行分級(jí)分離，結(jié)果顯示在第7管開(kāi)始出現(xiàn)cDNA(圖3)，收集第7～10個(gè)離心管內(nèi)cDNA，純化濃縮。

2.4 文庫(kù)的滴度與插入片段的PCR檢測(cè) 原始文庫(kù)的滴度為1.66×106pfu/ml，藍(lán)白斑篩選重組率為96.97%，擴(kuò)增文庫(kù)的滴度為3.88×109pfu/ml，達(dá)到文庫(kù)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)。隨機(jī)選取23個(gè)噬菌斑的PCR檢測(cè)，PCR產(chǎn)物主要位于500～1 000 bp(圖4)，符合EST測(cè)序的需要。

圖4 cDNA文庫(kù)插入片段的PCR產(chǎn)物

2.5 EST序列的分析 挑選5個(gè)單克隆，命名為cbsjzl1－5，(GenBank accession number:KM406240-KM406244)，進(jìn)行測(cè)序。5個(gè)單克隆均含有ORF和UTR，其中4個(gè)ESTs存在高相似度的序列，并有相對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)超家族，參與跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞的發(fā)育及分化等功能。

3 結(jié)論與討論

cDNA文庫(kù)是生物體某一時(shí)刻表達(dá)基因的集合，是獲取新基因的重要手段，已廣泛應(yīng)用于不同生長(zhǎng)階段基因表達(dá)變化的研究、某特定發(fā)育期基因表達(dá)情況及獲取組織特異性基因等方面［14－15］。影響cDNA文庫(kù)質(zhì)量的因素較多，mRNA的完整性、cDNA小片段及合適的載體都會(huì)對(duì)cDNA文庫(kù)的代表性造成影響。該試驗(yàn)中，采取Trizol法可高效快速提取雞爪苓菌絲體總RNA，降低mRNA的降解。通過(guò)CHROMA SPIN－400層析柱將cDNA分級(jí)分離，并選擇合適的cDNA片段。選擇λTripIEx作為載體，可提高某些低豐度基因的篩選率［16］。該試驗(yàn)成功構(gòu)建了雞爪苓菌絲體全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)，可進(jìn)行大規(guī)模的EST序列分析，為研究長(zhǎng)白山區(qū)雞爪苓的遺傳特異性、探索雞爪苓生長(zhǎng)分化的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

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