劉曉燕 吳亞坤 王建英 杜志強(qiáng)

（內(nèi)蒙古科技大學(xué) 數(shù)理與生物工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014010）

布魯菌是造成布病的直接病原，它可以在人畜之間傳播，造成人畜共患疾病[1]。目前，對于布病防治的策略，亞單位疫苗成為了一個(gè)新的熱點(diǎn)。本文以豬型布魯菌的omp31 基因（全ORF 序列）作為研究對象，進(jìn)行了蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)、蛋白純化、抗體制備與抗體質(zhì)量檢測等研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

含有pGEX-4T-1-omp31 重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21 表達(dá)菌株：試驗(yàn)前期構(gòu)建的表達(dá)菌株，在實(shí)驗(yàn)室低溫冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將試驗(yàn)前期構(gòu)建的含有pGEX-4T-1-omp31 重組質(zhì)粒表達(dá)菌株進(jìn)行過夜活化，之后轉(zhuǎn)接于新鮮LB 培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)培養(yǎng)4 h，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果利用SDS-PAGE 檢測[2]。

1.2.2 親和純化

收集誘導(dǎo)后的表達(dá)菌株菌體，利用超聲波進(jìn)行破碎，高速離心之后，將上清液利用GST 柱進(jìn)行親和純化[3]。

1.2.3 抗體制備將純化得到的重組蛋白作為抗原，與佐劑混合之后注射家兔，制備多克隆抗體，共需注射5 次，每次間隔10 天[4]。

1.2.4 抗體質(zhì)量檢測

抗體制備結(jié)束之后，收集家兔血清，利用western blot 方法檢測抗體質(zhì)量[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)與純化結(jié)果

將重組表達(dá)菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集菌體超聲波破碎之后，收集上清液進(jìn)行親和純化。SDS-PAGE 檢測結(jié)果顯示：重組蛋白正確表達(dá)，純化獲得介于43-66.2 kD 之間的重組蛋白質(zhì)，與預(yù)期的55.3 kD 一致。

圖1 布魯菌重組Omp31 的誘導(dǎo)表達(dá)與純化結(jié)果

2.2 Western blot 結(jié)果

以純化獲得的重組Omp31 蛋白作為抗原，與弗氏佐劑混勻之后，注射家兔制備多克隆抗體，收集血清之后進(jìn)行western blot 檢測。結(jié)果顯示：制備的多克隆抗體可以較好的識別抗原蛋白質(zhì)，說明重組Omp31 蛋白作為抗原的免疫原性良好。

圖2 western blot 檢測抗體質(zhì)量的結(jié)果

3 討論

目前，從基因入手研制蛋白類亞單位疫苗成為了一個(gè)新的科研熱點(diǎn)，針對布病的活菌疫苗存在反毒的現(xiàn)象，更加促進(jìn)了蛋白質(zhì)抗原疫苗的研究深度。本論文以豬型布魯菌的omp31 基因作為研究對象，對該基因的表達(dá)序列全長進(jìn)行了重組表達(dá)與抗體制備的研究，通過親和純化獲得了與預(yù)期分子量相一致的重組蛋白質(zhì)，利用其制備的多克隆抗體可以清晰的識別抗原分子，說明重組Omp31 蛋白質(zhì)具有較好的免疫原性，可以作為亞單位疫苗的候選分子進(jìn)行深入研究。

［1］史新濤，古少鵬，鄭明學(xué)，等.布魯氏菌病的流行及防控研究概況[J].中國畜牧獸醫(yī)，2010，37(3)：204-207.

［2］Ren Q，Zhou J，Jia YP，et al.Cloning and characterization of Rap GTPase from the Chinese white shrimp Fenneropenaeus chinensis [J].Dev Comp Immunol，2012，36(1)：247-252.

［3］Du ZQ，Ren Q，Zhao XF，et al.A double WAP domain (DWD)-containing protein with proteinase inhibitory activity in Chinese white shrimp，F(xiàn)enneropenaeus chinensis[J].Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol，2009，154(2)：203-210.

［4］Du ZQ，Li XC，Wang ZH，et al.A single WAP domain (SWD)-containing protein with antipathogenic relevance in red swamp crayfish，Procambarus clarkia[J].Fish Shellfish Immunol，2010，28(1)：134-142.

［5］Li XC，Du ZQ，Lan JF，et al.A novel pathogen -binding gC1qR homolog，F(xiàn)cgC1qR，in the Chinese white shrimp，F(xiàn)enneropenaeus chinensis [J].Dev Comp Immunol，2012，36(1)：400-407.